Control de microorganismos alterantes y patógenos de la leche y queso de oveja de la provincia de León por D-eritroascorbato, un análogo natural de la vitamina C y otros antioxidantes utilizados en la industria alimentaria

Resum

Para los estudios que desarrollamos en este trabajo fue necesario llevar a cabo la purificación del D-EAA y del D-EAAG presentes en extractos miceliales utilizando dos columnas de intercambio iónico dispuestas en serie: la primea de intercambio catiónico y la segunda de intercambio aniónico. La cuantificación e identificación de ambos compuestos se realizó mediante HPLC. A partir de muestras purificadas de D-EAAG determinamos la masa molecular de dicho compuesto mediante espectrometría de masas. El espectro de masas obtenido mostró una intensa señal a un valor de m/z a 307, que está de acuerdo con la fórmula molecular C11O10H16 (M=308), correspondiente a la forma monoglucósido del D-EAA. Las propiedades espectrales y constante de ionización del D-eritroascorbato glucosilado, similares a las del ácido L-ascórbico, son compatibles con la unión del resto glucídico al carbono 5 del D-eritroascorbato. En el estudio de las propiedades físico-químicas también determinamos la estabilidad de la forma glucosilada del D-EAA frente a la oxidación en disolución acuosa bajo condiciones aeróbicas y lo comparamos con los resultados obtenidos para el D-EAA. El D-eritroascorbato es más estable a pH 4 y pH 8 que a pH 6; el D-EAAG es mucho más estable con valores ácidos de pH que con valores básicos. Además el D-EAAG es más estable que el D-EAA a pHs ácidos, sin embargo a pH 8 sucede lo contrario, el D-EAA es más estable que el D-EAAG. El D-EAAG es sintetizado a partir de D-eritroascorbato por una glucosiltransferasa presente en micelio de P. blakesleeanus, que requiere UDP-glucosa como dador de grupos glucosilo. La máxima actividad glucosiltransferásica se obtiene en la fase estacionaria de crecimiento del hongo en concordancia con los niveles mas elevados de D-EAAG. El estudio cinético de la UDP-glucosa: D-EAA glucosiltranferasa fue llevado a cabo tanto para el sustrato dador como para el sustrato aceptor, obteniéndose en ambos casos una curva hiperbólica de saturación. Se determinó un valor de Km aparente de 2,5 mM y de Vmax aparente de 0,11 nmoles D-EAAG/min mg proteína para la UDP-glucosa; y un valor de Km aparente de 41,3µM y de Vmax aparente de 0,07 nmoles D-EAAG/min mg proteína para el D-EAA. Se estudió la producción de D-EAA y su glucósido utilizando distintas fuentes de carbono y de nitrógeno, tanto en luz como en oscuridad. El cultivo del hongo en presencia de D-arabinosa ó D-arabinono-1,4-lactona en luz conduce a la máxima producción de ambos compuestos, con un incremento de 30 veces del D-EAA y de 4 veces del D-EAAG respecto al control con glucosa. P. blakesleeanus excreta al medio de cultivo D-EAA y su forma glucosilada, siendo los niveles de D-EAA superiores a los de D-EAAG, lo que sería compatible con un sistema de transporte que presentaría una mayor afinidad por el D-EAA