Identificación y caracterización de bacterias que nodulan phaseoulus en diferentes regiones de españa

  1. GARCÍA FRAILE, PAULA
Supervised by:
  1. Encarna Velázquez Director
  2. Raúl Rivas González Co-director

Defence university: Universidad de Salamanca

Fecha de defensa: 09 May 2008

Committee:
  1. Andres Chordi Corbo Chair
  2. Pedro F. Mateos Secretary
  3. Juan Antonio Ocampo Bote Committee member
  4. Alvaro Peix Committee member
  5. Fernando González Andrés Committee member

Type: Thesis

Teseo: 228721 DIALNET

Abstract

Las leguminosas establecen simbiosis con un grupo de bacterias denominadas rhizobia que les permiten fijar el nitrógeno atmosférico en unas estructuras especializadas formadas en las raíces de las plantas denominadas nódulos, permitiendo así reducir el uso de fertilizantes químicos nitrogenados en la agricultura, disminuyendo los efectos negativos que el uso de estos fertilizantes conllevan tanto para el medio ambiente como para la salud humana. Para que esta simbiosis se produzca, es necesario que existan en el suelo poblaciones de microorganismos que establezcan simbiosis con la leguminosa a cultivar y fijen nitrógeno de forma eficaz. Esto no siempre es así, siendo entonces necesario añadir al suelo rhizobia adecuados. Esta práctica necesita un proceso previo de selección e identificación de los microorganismos, de modo que se añadan cultivos puros o mezclas conocidas de bacterias que además de ser eficaces, sean inocuas para el cultivo, plantas adventicias, animales o el hombre. El cultivo de la alubia (Phaseolus) es uno de los cultivos de leguminosas más importantes en España, de modo que resulta interesante profundizar en el estudio de bacterias que nodulan esta planta, que pueda servir como base para una mayor comprensión y promoción de esta simbiosis. Así, en este trabajo se realizó un aislamiento de bacterias a partir de nódulos de Phaseolus en diferentes regiones de España, escogiendo tres localidades de Castilla y León en las que el cultivo de alubia es muy común, ubicadas en zonas con IPG para dicho cultivo: Riego de la Vega (León), Granja de San Ildefonso (Segovia) y Barco de Ávila (Ávila); y otros suelos de distintas localidades de la Península Ibérica y Canarias: Guadájira (Badajoz), Alcalá del Río (Sevilla) y Guatiza (Lanzarote). Posteriormente se procedió a la caracterización e identificación de las cepas aisladas mediante el empleo de diversas técnicas: técnicas genotípicas, que incluyeron un análisis de los perfiles de TP-RAPD, un análisis de los perfiles de M13-RAPD, la secuenciación del gen ribosómico 16S, la secuenciación de los genes "housekeeping" atpD y recA, la secuenciación del espacio intergénico ITS1, y el análisis de las secuencias obtenidas de manera aislada y concatenada. Se realizaron también técnicas fenotípicas como el análisis de diversos caracteres fisiológicos como la morfología, el crecimiento en diferentes condiciones de temperatura, pH y salinidad, la resistencia natural a antibióticos y la utilización de diferentes sustratos como fuentes de carbono y/o nitrógeno, así como de diversos caracteres bioquímicos, tales como la producción de los enzimas catalasa, oxidasa y ureasa, la hidrólisis de celulosa y almidón y la hidrólisis de sustratos derivados del para-nitrofenol. Finalmente se completó el estudio con una caracterización simbiótica de las cepas aisladas que incluyó una secuenciación y análisis del gen simbiótico nodC, una evaluación del rango de hospedador y ensayos de inoculación para evaluación de la eficacia simbiótica de las cepas. Estos resultados nos permitieron clasificar e identificar a nivel de género y especie un total de 58 cepas de rhizobia, en diversas especies de los géneros Rhizobium y Sinorhizobium, que mostraron una gran diversidad genotípica y fenotípica, perteneciendo algunas de ellas a posibles nuevas especies del género Rhizobium y, algunas de ellas, eficiencias simbióticas significativamente superiores a los controles negativos. Además, hemos descrito una nueva especie de no-rhizobia, Cohnella phaseoli sp. nov., aislada a partir de nódulos de Phaseolus coccineus subsp. coccineus en suelo de La Granja de San Ildefonso (Segovia) en una revista de interés científico internacional: "I. J. Syst. Evol. Microb.". Para realizar la descripción de esta nueva especie, además de las pruebas realizadas a las restantes cepas, rhizobia, se llevo a cabo un análisis de diversos caracteres quimiotaxonómicos, tales cono el análisis de quinonas respiratorias, de lípidos polares y de ácidos grasos.