Purificación, caracterización y clonación de una beta-1,6-glucanasa de trichoderma harzianum

Résumé

Dentro del género Trichoderma se han encontrado numerosos agentes de control biológico frente a diversas enfermedades fúngicas de interés en agricultura. Entre los mecánimos por los que algunas cepas de Trichoderma antagonizan a otros hongos filamentosos destaca el proceso del micoparasitismo, en el que juegan un importante papel las enzimas hidrolíticas que Trichoderma produce, entre las que se encuentran las beta-1,6-glucanasas. Hasta la fecha se han descrito dos isoenzimas con esta actividad en T.harizanum. En este trabajo hemos purificado y caracterizado una tercera isoenzima, a la que llamamos BGN16.3, que se ha purificado de cultivos de T.harizanum CECT 2413 con paredes celulares de Botrytis cinerea como única fuente de carbono. La enzima fue purificada a homogeneidad electroforética en tres pasos: afinidad, cromatoenfoque y filtración en gel. BGN16.3 presentó una masa molecular de 48 KDa y un punto isoeléctrico de 4.1 en cromatoenfoque y 4.5 en isoelectroenfoque. Además se ha comprobado que posee efecto antilúngico frente a Penicillium digitatum tanto por sí sola como en combinación con otras enzimas hidrolíticas de Trichoderma. A partir de secuencias proteicas parciales de BGN16.3, utilizando la técnica de PCR con oligonucleótidos degenerados, se consiguió clonar un fragmento del gen que la codifica. Utilizando este fragmento como sonda se realizó un escrutinio de una genoteca de cDNA, consiguiendo un clon con el cDNA completo de bgn16.3, que fue caracterizado por medios bioinformáticos. Posteriormente también se clono el DNA genómico de BGN16.3, incluyendo 1.6 Kb de la región promotora del gen. Se llevaron a cabo estudios de regulación de la expresión del gen mediante Northern-blot observando como carácterísticas más interesantes la ausencia de expresión de la enzima en inducciones con quitina, sustrato habitualmente empleado para la obtención de enzimas hidrolíticas de Trichoderma. Mediant