Aplicaciones biotecnológicas para la propagación de pinus pinaster ait.

Resumen

En el panorama forestal europeo las coníferas tienen un papel decisivo tanto desde el punto de vista ecológico como forestal. Hoy, quizás más que nunca, son necesarias en grandes cantidades como colonizadores, productores de biomasa, bioenergía, etc. Con las nuevas planificaciones, progresivamente se están abandonando superficies dedicadas a otras prácticas agrícolas, con lo que cada vez existe más superficie disponible con fines silvícolas. Pudiendo aspirar a una explotación sostenible y duradera de las superficies excedentes de prácticas agrícolas marginales, sobre todo en zonas rurales donde las oportunidades de empleo son muy limitadas, la actuación forestal se encuentra muy justificada. En España, los pinos están representados por siete especies autóctonas, entre éstos el pino marítimo, negral, rodeno o resinero (Pinus pinaster), conífera ampliamente distribuida en la cuenca del Mediterráneo occidental (Europa del Sur y África) y la costa Atlántica de Portugal, España y Francia, es una especie modelo para la investigación genómica en Europa. Por este motivo ha sido elegida por el consorcio SustainPine (http://www.scbi.uma.es/sustainpine/index.html) para sus investigaciones sobre genómica y estudio de genes candidatos implicados en desarrollo, crecimiento y respuestas a estrés. Además, ha sido incluida como una de las especies modelo en la Red de Excelencia Europea EVOLTREE (http://www.evoltree.eu). En los últimos años se ha observado un incremento en la necesidad de su madera y sus subproductos y se espera que dicha demanda aumente en el futuro. En esta memoria de Tesis se describen diferentes herramientas biotecnológicas para la mejora de la propagación de pino marítimo. Los objetivos concretos y tareas son desarrollados en 5 capítulos: 1. Desarrollo de un protocolo de regeneración de plantas de P. pinaster mediante micropropagación, vía caulogénesis adventicia directa, desde su fase de inducción en cotiledones hasta su aclimatación en el invernadero. 2. Optimización de un método completo de regeneración de plantas de P. pinaster mediante micropropagación, vía embriogénesis somática, desde la inducción en embriones inmaduros hasta su aclimatación en el invernadero. Incluyendo un protocolo robusto de crioconservación que permita mantener el potencial embriogénico de las líneas obtenidas. 3. Desarrollo de un método de transformación genética, mediada por Agrobacterium tumefaciens, de masas embriogénicas de P. pinaster hasta la obtención de planta transgénica que permita el estudio funcional de genes candidatos. 4. Clonación, caracterización y estudio de la expresión diferencial de un gen regulador de respuesta tipo A en cotiledones de P. pinaster durante la inducción caulogénica. Así como, clonar la región promotora del mismo en un plásmido binario y transformar genéticamente masa embriogénica para el análisis funcional del promotor. 5. Clonación, caracterización y estudio de la expresión diferencial de un gen LRR protein kinase receptor en cotiledones de P. pinaster durante la inducción caulogénica. Así como, clonar la región promotora del mismo en un plásmido binario y transformar genéticamente masa embriogénica para el análisis funcional del promotor. Como resultado de los trabajos realizados: Se ha obtenido un protocolo mejorado de micropropagación vía caulogénesis adventicia directa a partir de cotiledones aislados de pino marítimo. En general, se puede decir que el protocolo obtenido mejora desde un punto de vista productivo los descritos con anterioridad al aumentar la supervivencia de los cotiledones desde un 65% a más del 80%. Se reducen los tiempos de cultivo eliminando el periodo de germinación de los embriones (8 d) previo a la inducción y acortando el periodo de inducción caulogénica de 21 a 14 días. Además, incrementa el porcentaje de enraizamiento de un 60 a un 86 % y disminuye la duración de esta fase a 5 semanas. Una novedad introducida en este protocolo es la posibilidad de usar los braquiblastos surgidos durante la elongación de los tallos como fuente de nuevos microtallos. Las aplicaciones de este trabajo son variadas ya que se puede utilizar por una parte para obtener material clonal a partir de semillas de familias seleccionadas, que podría ser utilizado en estudios de mejora genética, y por otro lado como sistema experimental, tanto para estudios de expresión génica diferencial en respuesta a hormonas como para estudios de marcadores de desarrollo temprano de xilema. También se ha obtenido un protocolo de micropropagación vía embriogénesis somática a partir de embriones cigóticos inmaduros de pino marítimo de procedencia asturiana. Se ha determinado el periodo estacional durante el que es posible la inducción embriogénica así como aquellos genotipos de entre los ensayados que responden mejor. Esto permitirá ahorrar tiempo y trabajo en futuras inducciones. Además, se ha optimizado el proceso de maduración (cuello de botella del proceso embriogénico), incrementando el número de embriones maduros obtenidos más de un 25%. Por otro lado, se ha desarrollado un protocolo eficiente de crioconservación que permite la recuperación de todos los genotipos ensayados. La obtención de un protocolo de crioconservación es imprescindible para el proceso embriogénico debido a la perdida de potencial que se produce al aumentar el número de subcultivos. La embriogénesis somática, además de una importante vía de propagación clonal, proporciona un material idóneo para la transformación genética. Esta última vía abre un abanico de posibilidades para la mejora genética y la validación y caracterización de genes candidatos. Por este motivo, se ha optimizado un protocolo de transformación genética de masas embriogénicas mediado por Agrobacterium tumefaciens. Hasta el momento, sólo existen dos trabajos de transformación genética en pino marítimo. Ambos trabajos utilizan como agente selectivo el antibiótico higromicina y en sólo uno de ellos se obtiene planta transgénica. En el protocolo presentado se describe por primera vez el uso del antibiótico kanamicina como agente selectivo para la obtención de planta transgénica. Por otro lado, en trabajos previos en nuestro laboratorio se han identificado dos secuencias expresadas diferencialmente durante la inducción caulogénica en pino piñonero (P. pinea) que muestran homología, una de ellas con los Reguladores de Respuesta tipo A y la otra con el gen CLAVATA1 de Arabidopsis. Mediante la técnicas RACE y paseo cromosómico hemos clonado la secuencia completa de ambos genes en pino marítimo (PipsRR1 y PipsCLV1L, Genbank JQ801609 y HQ377527 respectivamente). Además, se ha estudiado la expresión diferencial de ambos genes durante el proceso de inducción caulogénica en cotiledones escindidos de pino marítimo. Los resultados muestran que ambos genes se encuentran sobre-expresados durante los primeros momentos de la inducción para posteriormente disminuir hasta niveles basales a los 6 días. Estos resultados parecen indicar que ambos genes juegan un papel durante la caulogénesis adventicia en coníferas. Para profundizar en su estudio, se ha clonado un fragmento de unas 1.500 pb aguas arriba de la región 5¿ del gen y se ha construido un plásmido binario (uno para cada gen) basado en el sistema Gateway® en donde la región promotora de nuestro gen dirige la expresión de una proteína fusión de GFP:GUS. Nuestro objetivo ha sido comprobar que las construcciones son funcionales. Para ello, se han transformado genéticamente, aplicando el protocolo desarrollado anteriormente, masas embriogénicas de pino marítimo y se han analizado 24 eventos de transformación independientes para cada construcción. Los resultados moleculares confirman la incorporación del transgén en el genoma vegetal para todos los eventos. Los resultados histoquímicos también muestran actividad ß-glucuronidasa en todas las líneas, demostrando de esta forma la expresión del gen y por tanto que las construcciones son funcionales. Se ha analizado la expresión de los genes, mediante actividad ß-glucuronidasa, durante la proliferación de la masa embriogénica transformada así como en diferentes puntos del proceso de maduración. Las líneas transgénicas se hayan crioconservadas para profundizar en su estudio en un futuro. El desarrollo de esta Tesis ha sido posible gracias a la financiación obtenida de diversos organismos: ¿ Beca FPU referencia AP2005-0140 del Ministerio de Educación y Ciencia. ¿ Análisis genómicos funcionales de la formación de madera en coníferas: obtención y evaluación de árboles transgénicos alterados en la producción y calidad de la madera (AGL2006-07360/FOR). ¿ Bases fisiológicas y moleculares de la formación y desarrollo de tallo en coníferas (PCTI Asturias: IB08-054). ¿ Bases Fisiológicas y Moleculares de la caulogénesis y xilogénesis en Pinus pinaster Ait. (AGL2009-12139-C02-01).