Desarrollo de nuevas herramientas biotecnológicas para la manipulación de la quimiorresistencia y como biosensores de agentes gentóxicos

Resumen

[ES]La genotoxicidad es la capacidad relativa de un agente químico, físico o biológico de ocasionar daño en el material genético, pudiendo dar lugar a efectos biológicos adversos, tales como la carcinogénesis. El cáncer es uno de los principales problemas de salud en el mundo; la eficacia de su tratamiento con quimioterapia se ve limitada por el desarrollo de resistencia tumoral a los fármacos citostáticos. Por tanto, resulta de vital importancia desarrollar tanto ensayos que permitan caracterizar y detectar los agentes genotóxicos, así como estrategias que permitan superar la quimiorresistencia y vectorizar los fármacos hacia el tumor. En primer lugar, se desarrolló el biosensor microbiano prRecA-Luc2 basado en la respuesta SOS, un sistema de reparación del ADN bacteriano en el que la proteína RecA actúa como inductor del sistema. Se eligió esta proteína como el elemento biológico en el que fundamentar el funcionamiento del biosensor, constituído por bacterias E.coli BL21(DE3) transformadas con un plásmido en el que se clonó el gen reporter que codifica para la luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor del gen recA. Se puso a punto un ensayo in vitro de genotoxicidad basado en el biosensor citado, en el que se fijaron las condiciones óptimas de medida de la actividad luciferasa en situaciones de actividad basal del promotor del gen recA o inducida por agentes genotóxicos. Su uso ha resultado útil para detectar la capacidad genotóxica de diferentes contaminantes ambientales caracterizados por un mecanismo de daño directo sobre el ADN y que pueden contaminar la alimentación del ganado. También ha permitido determinar el papel genotóxico y carcinogénico de los metabolitos de la tioacetamida, así como descartar que los ácidos biliares por sí solos, tengan un papel iniciador como agentes genotóxicos en el desarrollo de colangiocarcinomas. Por otra parte, de las proteínas implicadas en los mecanismos de quimiorresistencia, centramos la atención en la proteína asociada a la resistencia a múltiples fármacos MRP2 (gen ABCC2), localizada en la membrana canalicular de los hepatocitos, y en la survivina (gen BIRC5), una proteína antiapoptótica cuya expresión se encuentra incrementada de manera muy marcada en diferentes tipos de tumores hepáticos. Teniendo en cuenta la activación de estas proteínas en las células tumorales, desarrollamos dos estrategias de terapia génica basadas en la fusión transcripcional de los promotores de los genes ABCC2 y BIRC5 con la secuencia codificante de las proteínas de captación de fármacos antineoplásicos OATP1B1 y OATP1B3, respectivamente. Tras comprobar que el promotor del gen ABCC2 es activo e inducible en células de hepatoma humano, demostramos que el gen quimérico basado en la actividad de dicho promotor mejora la eficacia del tratamiento con fármacos antitumorales sustratos de OATP1B1 y su efecto quimiosensibilizante se ve potenciado en quimioterapia combinada con un activador del promotor de MRP2, como la dexametasona. Además, restituye la respuesta antitumoral a los fármacos citostáticos que sean sustrato de OATP1B1 en células tumorales en las que durante el tratamiento se ha perdido sensibilidad a la quimioterapia debido, en parte, a la sobreexpresión de proteínas de quimiorresistencia, como la MRP2. También se demuestra el efecto quimiosensibilizante de la estrategia de terapia génica basada en la fusión transcripcional de OATP1B3 con el promotor del gen BIRC5 en las células tumorales. Esta estrategia cuenta con dos ventajas importantes: su alta selectividad en lo que se refiere a la sensibilización específica de las células tumorales y no de las células sanas y la frecuente presencia de la característica determinante de sobre-activación del promotor de BIRC5 en muchos tipos tumorales.