Contribución al estudio del sistema de lipasas de Trichoderma harzianum

Laburpena

[ES]Entre los hongos del género Trichoderma se han descrito algunas especies importantes como agentes de biocontrol, tales como las parejas anamorfo/teleomorfo T. harzianum/Hypocrea lixii, T. viride/H. rufa, T. atroviride/H. atroviridis y T. virens/H. virens. Trichoderma tiene una amplia distribución geográfica, está presente en casi todos los suelos y en hábitats diversos (creciendo en madera, corteza, sobre y dentro otros hongos y sustratos innumerables). Por su adaptación a distintos entornos, los hongos del género Trichoderma pueden sobrevivir bajo un amplio rango de condiciones. Su crecimiento es muy rápido. La interacción con otros microrganismos incluye competición por nutrientes y espacio, antibiosis e hiperparasitismo. En el proceso de hiperparasitismo, Trichoderma spp. reconocen a los fitopatógenos, atacándolos, y penetrando gradualmente sus células, provocándoles la muerte. Las enzimas líticas producidas por Trichoderma spp. juegan un papel considerable en el proceso de hiperparasitismo. Además de producir quitinasas y glucanasas (?-1,3 y ?-1,6-glucanasas), capaces de degradar las paredes celulares de los hongos fitopatógenos, constituidas por quitina y glucanos, la capacidad de Trichoderma de producir celulasas (?-1,4-glucanasas) le permite hiperparasitar oomicetos como Phytophthora spp. o Pythium spp. A su vez, las proteasas afectan a la actividad enzimática de hongos fitopatógenos como Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum, y del nemátodo Meloidogyne javanica, pero también ejercen un control sobre la actividad y estabilidad de las enzimas extracelulares de Trichoderma. Además de producir enzimas hidrolíticas capaces de degradar las hifas de fitopatógenos y parasitarlos (quitinasas, glucanasas, celulasas, proteasas y lacasas), Trichoderma spp. consigue colonizar y degradar numerosas estructuras de resistencia que permanecen en el suelo, constituyendo un foco de infección para las plantas, como los esclerocios de Sclerotinia spp., Sclerotium rolfsii, B. cinerea y R. solani. Por todo esto, se ha hecho popular su utilización como biofungicida. Aúnque se han identificado numerosas enzimas líticas, poco o nada se ha publicado sobre la existencia de lipasas, y luego sobre su modo de acción, o su implicación en los procesos de interacción de Trichoderma con otros hongos y con las plantas. Tampoco se han determinado sus potenciales aplicaciones biotecnológicas. Se sabe que las lipasas son consideradas los biocatalizadores más versátiles, por tener la capacidad de llevar a cabo diferentes transformaciones químicas sobre un amplio rango de sustratos naturales o no. Estas reacciones transcurren generalmente con características de gran quimioselectividad, regioselectividad y enantioselectividad, volviendo estas enzimas fundamentales en procesos de transformación industrial, tanto más que son enzimaticamente activas en solventes orgánicos más hidrofóbicos, y estables, lo que las hace ideales como herramientas en distintos procesos industriales, tales como procesamiento de alimentos, detergentes, aceites y grasas, cosméticos, productos farmacéuticos, agroquímicos, energía, textiles, papel, degrasamiento de pieles, producción de polímeros biodegradables y de biodiesel. Así, esta tesis doctoral está enfocada al aislamiento, caracterización y análisis funcional de genes de T. harzianum T34, que codifiquen enzimas con actividad lipolítica (EC 3.1.1). A partir de las secuencias nucleotídicas contenidas en dos ESTs de T. harzianum (EST-1279 y EST-9632), y usando la técnica de HE-TAIL PCR (High-Efficiency Thermal Asymetric Interlaced PCR), se han aislado los genes lip1 y lip2, que codifican una carboxilesterasa de tipo B (PROSITE PS00122) y una lipasa clase 3 (PROSITE PS00120), respectivamente. Posteriormente, se obtuvieron transformantes del gen lip1 en Pichia pastoris GS115. Lip2, con el número de acceso AM774154.1 en las bases de datos tiene un total de 1992 nucleótidos, que abarcan 548pb del promotor, 1215pb de la fase de lectura abierta y un terminador con 227pb. El número de acceso de la secuencia de aminoácidos codificada por lip2 en la base de datos de UniProt es B7ZET5_TRIHA. Lip1 se encuentra como copia única en el genoma de T. harzianum T34, y no existe un gen homólogo en T. atroviride, T. reesei y T. virens. Lip1 codifica una proteína deducida de 532 aminoácidos y 56,3KDa. Su número de acceso en la base de datos de UniProt es B0B099_TRIHA. Su secuencia nucleotídica puede ser accedida en AM180877.1. Lip1 presenta actividad lipolítica en tributirina, o en aceites vegetales como los de maíz, oliva o soja, pero especialmente en el último. No utiliza sustratos como el palmitato, lo que está de acuerdo con el hecho de ser una carboxilesterasa con preferencia por ácidos grasos de cadena corta. Su expresión en T. harzianum T34 es inducida por la presencia de sustrato.