Toxoplasmosis ovinainfluencia del momento de infección en la patogenia y respuesta inmunitaria durante la gestación

Zusammenfassung

La toxoplasmosis ovina es una enfermedad infecto-contagiosa causada por el protozoo parasitario Toxoplasma gondii (T. gondii), con una elevada incidencia en la ganadería ovina en todo el mundo, donde provoca importantes pérdidas económicas al estar asociada a fallo reproductivo, generalmente aborto. Aunque se sabe que el momento de gestación en el que ocurre la primoinfección de las ovejas gestantes determina las consecuencias clínicas de la enfermedad, no se conocen con exactitud los mecanismos patogénicos que explicarían esas diferencias. Uno de ellos podría ser la respuesta inmunitaria desarrollada tanto por la madre gestante como por el feto, a nivel periférico y de la placenta, pues éste es un factor clave en el control de la infección y multiplicación del parásito. De esta manera, el objetivo general de esta Tesis Doctoral es analizar cómo influye el momento de gestación en el que ocurre la infección con T. gondii sobre la respuesta inmunitaria materna y fetal, a nivel sistémico y local, y la posible relación con la aparición de abortos o transmisión vertical. Para su abordaje se han desarrollado tres estudios en los que además se pretende dar respuesta a objetivos de carácter más específico. Para ello, 36 ovejas gestantes, primíparas, de raza Churra y de la misma edad se distribuyeron al azar en 3 grupos experimentales, cada uno de ellos formado por 9 ovejas infectadas y 3 no infectadas. La reproducción experimental de la enfermedad se produjo empleando una misma dosis infectiva en todos los grupos, 50 ooquistes esporulados del aislado M4 de T. gondii (tipo II) administrados por vía oral. De esta manera, la infección se llevó a cabo a los 40 (G1), 90 (G2) y 120 (G3) días de gestación. Tras la inoculación, se planificó el sacrificio secuencial de 3 animales infectados y 1 control en los días 12, 19 y 26 post-infección (pi). El primero de los tres estudios de esta Tesis Doctoral se desarrolló con el objetivo concreto de esclarecer qué influencia ejerce el momento de gestación en el que se infecte a las ovejas gestantes sobre la clínica de la toxoplasmosis ovina, las lesiones fetales y placentarias y también sobre la colonización y multiplicación del parásito en estos tejidos. Para ello, tras la infección se realizó el seguimiento clínico de los animales, siendo posteriormente sacrificados, o bien en el momento en el que se produjeron abortos espontáneos o bien cuando estaba previsto su sacrificio secuencial. Tras la necropsia, se recogieron muestras fetales (suero o líquido torácico) para la detección de anticuerpos específicos frente a T. gondii. Además, se recogieron diferentes muestras tanto en el feto (encéfalo, hígado, corazón y pulmón) como en la placenta (5 placentomas seleccionados al azar) para su fijación en formol y posterior análisis histológico o bien su almacenamiento a -80ºC para después detectar y cuantificar, mediante qPCR, ADN de T. gondii analizando estadísticamente las diferencias entre grupos. La consecuencia clínica más destacable fue la aparición de abortos entre los días 6 y 26 pi que se clasificaron en dos categorías: abortos tempranos (entre los 6 y 16 días pi) o abortos tardíos (entre los días 17 y 26 pi). Los tempranos ocurrieron en los animales infectados de los tres grupos, por lo que en su aparición no influye el momento de gestación en que se produzca la infección de la madre gestante. Además, puesto que la detección de ADN parasitario en los fetos o placentas de los tres grupos fue muy esporádica y puntual en ese intervalo temporal y sucedió en un número muy escaso de muestras, se confirmó que estos abortos tempranos no estarían causados por la multiplicación del parásito en la placenta. Igualmente, la presencia del parásito tampoco es necesaria para la aparición de las lesiones características de este tipo de abortos, consistentes en trombosis e infartos en la placenta y áreas de leucomalacia fetal, observadas solamente en algunos de los encéfalos fetales estudiados. En resumen, el momento de gestación en que se infecta a las ovejas gestantes no ejerce ninguna influencia sobre la aparición de los abortos tempranos, ni sobre el tipo de lesiones fetales o placentarias asociadas o su gravedad, ni sobre la presencia del parásito en ellos. Sin embargo, al considerar los abortos tardíos, el tercio de gestación en el que se infectan las ovejas sí influye sobre la invasión de la placenta por el parásito, la aparición de lesiones y la consecución de estos abortos. La muerte fetal, con o sin aborto, entre los días 17 y 26 pi fue más frecuente en el grupo de animales infectados a final de la gestación (66,6%) que en los otros dos grupos (16,7% en ambos casos). El momento de gestación en que se produjo la infección de las ovejas gestantes también influyó sobre la colonización del parásito de la placenta y posterior multiplicación en este tejido y en el feto, así como en la aparición y gravedad de las lesiones asociadas. Tanto la llegada del parásito a la placenta tras la infección como la aparición de lesiones se detectaron antes, en el día 19 pi, en el G3 en comparación con los otros dos grupos experimentales, donde sólo se detectaron en el día 26 pi. Además, el aumento de carga parasitaria entre la tercera y cuarta semana pi fue muy brusco en los G1 y G2, mientras que en el G3 ese aumento fue muy leve. Dado que a lo largo de todo el experimento solamente se detectaron anticuerpos específicos frente al parásito en fluidos fetales del G2 y, principalmente, en el G3, es posible que la mayor maduración del sistema inmunitario fetal sea la causa de la aparición de estos anticuerpos y, a su vez, del menor incremento en la carga parasitaria observado en el G3, de forma que hubiera sido capaz de limitar en cierto modo la replicación del parásito y dificultar su diseminación hacia otros tejidos. Esta hipótesis también podría explicar que las lesiones de menor gravedad, tanto en la placenta como en el feto, correspondan a las muestras analizadas del G3. Por el contrario, las lesiones más graves y extensas se encontraron en las muestras procedentes de las ovejas infectadas a mitad de la gestación, detectándose en estos mismos animales las mayores cargas parasitarias de todo el experimento. Sin embargo, las características histológicas de las lesiones son muy similares, independientemente del tercio en el que se produzca la infección. Siempre se correspondieron con inflamaciones necróticas multifocales con infiltrados de macrófagos y linfocitos. Por otro lado, dado que siempre se detectó ADN de T. gondii en todas las muestras donde se encontró lesiones, parece claro que, en los abortos o transmisión fetal ocurridos más allá de la segunda semana pi, para el desarrollo de las lesiones es condición necesaria la colonización previa del parásito de estos tejidos. En conjunto, los resultados del primer estudio demuestran que el momento de gestación en que ocurra la infección de la oveja gestante determina claramente las consecuencias clínicas de la enfermedad, de influir en la llegada del parásito a la placenta y feto y posterior desarrollo de lesiones. En el segundo trabajo de esta Tesis Doctoral el objetivo concreto que se planteó fue analizar la respuesta inmunitaria, tanto periférica como a nivel de la placenta, de los mismos animales que los del anterior trabajo. Para ello, se cuantificaron los niveles circulantes de anticuerpos específicos frente a T. gondii en muestras de suero maternas y fetales, así como los de citoquinas de tipo Th1 (IFN-γ y TNF-α), Th2 (IL4) y Treg (IL10) en suero materno. También se analizaron los niveles de transcripción de ARNm de estas cuatro citoquinas, así como de IL12, a nivel de la placenta, mediante qPCR. Durante la fase inicial de la enfermedad, en concreto en los días 5 y 8 pi, se detectaron niveles séricos significativamente mayores de IFN-γ en todos los grupos experimentales con respecto al grupo control, aunque no existieron diferencias significativas entre los grupos infectados. Estos hallazgos confirman que en las fases iniciales de la enfermedad predomina una respuesta inmunitaria de tipo celular. Tras este aumento en la producción de IFN-γ, sus niveles circulantes decrecieron rápidamente coincidiendo con un incremento en la producción de anticuerpos específicos frente a T. gondii, así como de TNF-α e IL10. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos infectados más que en días concretos y de forma puntual. Sin embargo, los tres grupos infectados presentaron clara, y significativamente, una mayor cantidad de estas citoquinas que el grupo control. Por otro lado, no se detectaron niveles circulantes apreciables de IL4. Estos resultados en conjunto demuestran que el momento de gestación en que se produce la infección de las ovejas gestantes con T. gondii no influye sobre la respuesta inmunitaria periférica desarrollada por los animales, la cual se caracteriza por la producción de citoquinas tanto de tipo Th1 como de tipo Treg, sin que exista una polarización clara hacia uno u otro tipo de respuesta a medida que avanza la gestación. Al igual que a nivel periférico, la repuesta inmunitaria local estaba caracterizada por la producción de citoquinas de tipo Th1, Th2 y Treg. Es de destacar que, de manera similar a lo observado a nivel periférico, los mayores niveles de expresión de ARNm en la placenta correspondieron a IFN-γ. Sin embargo, aunque, salvo en el caso de IL12, se encontraron diferencias significativas entre los animales infectados y los controles, las diferencias entre grupos infectados sólo fueron significativas en el caso de IL4 e IL10. En concreto, los niveles de IL4 fueron mayores en los G1 y G2, mientras que los de IL10 fueron mucho más elevados en el G3. Estos resultados demuestran, por un lado que la respuesta inmunitaria periférica y local difieren a lo largo de la infección y que el momento de gestación en que se produce la infección no influye sobre los niveles séricos de las citoquinas estudiadas, pero sí sobre los niveles de expresión de IL4 e IL10 en la placenta, y por otro lado que a medida que avanza la gestación la respuesta inmunitaria desarrollada en la placenta frente a la infección por T. gondii sufre una modulación caracterizada principalmente por una mayor expresión de IL10. El tercer objetivo concreto de esta Tesis Doctoral fue analizar si el momento de gestación en que se produjo la infección de los animales con T. gondii influye sobre las poblaciones celulares concretas que constituyen los infiltrados inflamatorios observados en la placenta y la distribución del parásito en este órgano. Para ello, se utilizaron métodos inmunohistoquímicos mediante el empleo de anticuerpos específicos frente a diferentes antígenos: del parásito y de diferentes poblaciones celulares (células NK, B, T y macrófagos). No obstante, debido a la aparición de abortos tempranos en la fase aguda de la toxoplasmosis y de la expulsión de mortinatos en G3, las muestras de placenta de estos animales estaban muy autolíticas, lo que impedía su correcta valoración histológica. Debido a esta limitación en el número de muestras, no se tuvo en cuenta el momento de gestación en que se infectó a los animales y las comparaciones se realizaron entre tres grupos de ovejas: aquellas no infectadas, las que abortaron y las que fueron sacrificadas. Solamente se detectó antígeno parasitario mediante análisis inmunohistoquímico en las placentas de los animales sacrificados en la cuarta semana pi, pues en este momento, como se explicó anteriormente, es cuando se detectó no sólo ADN de T. gondii sino también lesiones en la placenta y vísceras fetales de todos los animales infectados. No obstante, la distribución de antígeno parasitario fue diferente en la parte materna y fetal: mientras que en aquella se encontraban restos de parásito, denominado antígeno particulado, asociados con áreas de infiltración de linfocitos y macrófagos y/o áreas de necrosis, en la parte fetal la morfología del parásito estaba más conservada, con una estructura semejante a las vacuolas parasitóforas, frecuentemente observado en el interior de trofoblastos y nunca se encontraba asociado a áreas de necrosis. Estos resultados plantean la posibilidad de que los trofoblastos fetales sean más susceptibles a la infección con T. gondii y que la respuesta inmunitaria fetal no sea tan efectiva a la hora de controlar la replicación del parásito, lo que favorecería su multiplicación, al contrario de lo que ocurriría en la parte materna de la placenta. Respecto a la distribución de los distintos subtipos celulares, un resultado muy destacado fue que el número de células NK+ y B+ fue muy reducido, no solamente en los animales infectados sino también en los controles. Esto parece demostrar que estas células no son importantes en la respuesta inmunitaria desarrollada en la placenta durante la toxoplasmosis ovina. Por el contrario, es de especial relevancia el hecho de que la positividad asociada a las células T y macrófagos, así como su distribución, estuviera condicionada por la presentación clínica de la enfermedad. En concreto, en las ovejas que sufrieron abortos tempranos se detectó una predominancia de macrófagos en el infiltrado inflamatorio siempre restringido a la carúncula materna. Por el contrario, en la placenta de las ovejas sacrificadas en la cuarta semana pi (en las que se había detectado la presencia del parásito por PCR e inmunohistoquímica), los infiltrados inflamatorios asociados con la multiplicación del parásito consistían tanto en linfocitos T como en macrófagos, restringidos siempre a las vellosidades fetales de la placenta. Además, en este último caso se demostró que, dada la ausencia de positividad asociada a la calprotectina, los macrófagos implicados en la respuesta inmunitaria local serían aquellos residentes de manera constitutiva en este tejido. En resumen, los resultados de esta Tesis Doctoral demuestran que la llegada de T. gondii a la placenta ovina y posterior multiplicación en este tejido y en el feto, así como la gravedad de las lesiones asociadas, están influidas por el momento de gestación en que ocurra la infección. Se demuestra también la importancia de la respuesta inmunitaria local, a nivel de la placenta, que presenta diferencias con respecto a la materna periférica, y cuyo infiltrado inflamatorio difiere en función de la presentación clínica de la enfermedad.