Estudio y purificación de peroxidasas implicadas en la lignificación de plantas basales

Resumen

La colonización del medio terrestre por las plantas ha conducido al desarrollo de diferentes mecanismos que permiten la supervivencia en un entorno hostil. Una de estas adaptaciones ha sido la presencia de ligninas y proceso lignificación, que otorgaron a las plantas la mejora necesaria para tener un porte erguido y transportar el agua de manera eficiente. Los primeros organismos que colonizaron la tierra fueron las plantas no vasculares, estas especies presentaban una estructura simple, pero tenían una alta capacidad de adaptación bajo diversos estreses. Estas primeras plantas se clasificaron como briófitos y se dividieron en tres grupos; hepáticas, musgos y anterófitos. Los briófitos no presentan un sistema vascular y la mayoría de ellos no tienen lignina. Sin embargo, se han encontrado algunas excepciones, como la hepática Marchantia polymorpha que posee ligninas guayacilo y siringilo, y el musgo Physcomitrella patens, que a pesar de no contener ligninas, tiene la capacidad para oxidar a los alcoholes coniferílico y sinapílico, que están relacionados con la biosíntesis de unidades guayacilo y siringilo respectivamente. Las primeras plantas vasculares fueron los pteridófitos, que contienen en su pared ligninas predominantemente de tipo guayacilo. Sin embargo, se han encontrado numerosas excepciones, tal como el licófito Selaginella martensii, que contiene un 70% de ligninas de tipo siringilo con una menor proporción de unidades guayacilo, una característica típica de las angiospermas. Esta producción de ligninas siringilo se produce a través de un novedoso mecanismo de síntesis, en el que se han desarrollado dos nuevas enzimas para complementar la falta de la ferulato 5-hidroxilasa (F5H) y el ácido cafeico O-metil-transferasa (COMT), que son las enzimas necesarias para la producción de ligninas de tipo siringilo. Estas características hacen que el estudio de estas tres especies sea de gran interés en la biosíntesis de las ligninas siringilo. Por otra parte, las peroxidasas básicas se han caracterizado como responsables de la oxidación de alcohol sinapílico en varios trabajos. Por lo tanto es necesario un estudio en profundidad de las peroxidasas básicas presentes en estas tres especies basales. Por medio de histoquímica, M. polymorpha mostró colocalización de la actividad peroxidasa y ligninas en sus rizoides. Por otra parte, el análisis mediante isoelectroenfoque determinó la presencia de peroxidasas con un punto isoeléctrico similar al de la peroxidasa básica responsable de la lignificación de Z. elegans. Debido a esto, las peroxidasas de M. polymorpha se purificaron usando un protocolo en tres pasos que incluía la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía de adsorción en Fenil Sefarosa y la cromatografía de intercambio catiónico en SP Sefarosa, lográndose obtener una fracción enriquecida en peroxidasas básicas que presentaba la capacidad para oxidar al ácido ferúlico y a los alcoholes coniferílico y sinapílico. Estas características apoyan el hecho de que estas peroxidasas están involucradas en la lignificación de esta especie. La segunda de las especies empleadas para este trabajo, P. patens, es una especie sin ligninas pero que muestra la presencia de compuestos fenólicos similares a las ligninas. La purificación de las peroxidasas de esta especie se llevó a cabo mediante un protocolo en tres pasos similar al realizado en M. polymorpha. Este proceso nos permitió aislar una peroxidasa (PpPrx) con un punto isoeléctrico de 10,04 y un peso molecular de 36,5 kDa. Esta peroxidasa presenta la capacidad de oxidar tanto a los alcoholes coniferílico como sinapílico. Además, el análisis cinético mostró una elevada eficiencia catalítica frente el alcohol coniferílico, similar al hallado en otras peroxidasas involucradas en la lignificación de otras especies. Para comprobar cómo actuaba esta enzima frente diversos tipos de estrés abiótico, las plantas de P. patens mantenidas en cultivo líquido con agitación se trataron con compuestos que activaban la vía de señalización de ABA (ácido abscísico, cloruro de sodio y manitol), un compuesto implicado en la respuesta a patógenos (ácido salicílico) y un compuesto que activaba la ruta de estrés oxidativo (peróxido de hidrógeno). Los parámetros analizados tras la realización de los tratamientos fueron el pH del medio de cultivo, la actividad peroxidasa total, los patrones de proteínas y peroxidasas y la biosíntesis de fenoles. Curiosamente, la peroxidasa previamente purificada, PpPrx, fue inducida con los tratamientos con cloruro de sodio y peróxido de hidrógeno, e inhibida por los tratamientos con ácido abscísico y manitol. Además se estudió el secretoma radicular de P. patens en dos etapas de desarrollo con el fin de comprobar qué proteínas eran secretadas en el medio de cultivo por rizoides en condiciones normales, identificándose un total de 47 proteínas en los cultivos de 7 días (en fase de crecimiento) y 67 proteínas en los cultivos de 28 días (en fase senescente). Estas proteínas se agruparon en función de su participación en diversos procesos de la planta, tales como la modificación de la pared celular, la senescencia o la regulación. Con la última de las especies a estudiar, S. martensii, los cortes histológicos mostraron una colocalización de la actividad peroxidasa y las ligninas, considerando que las ligninas guayacilo se encuentran en el xilema, mientras que las ligninas siringilo están localizadas en la epidermis y la epidermis subcortical. Para purificar las peroxidasas básicas de esta especie se llevó a cabo un protocolo de purificación en tres etapas similar al descrito previamente. Así se obtuvieron tres fracciones de peroxidasas básicas; una fracción semipurificada (SmaPrx1) y dos proteínas purificadas a homogeneidad (SmaPrx2 y SmaPrx3). La fracción SmaPrx1 mostró la presencia de peroxidasas de carácter fuertemente básico y un peso molecular típico de las peroxidasas de clase III. Por otra parte, las actividades frente a diversos sustratos sugieren que estas peroxidasas están involucradas en la lignificación. El peso molecular para las peroxidasas purificadas a homogeneidad, SmaPrx2 y SmaPrx3 se calculó en 36,3 kDa y 45,6 kDa respectivamente de acuerdo con la técnica de MALDI-TOF/TOF. Ambas enzimas muestran además un espectro de absorción UV-visible típico, con un pico Soret a 403 nm y 404 nm respectivamente. Además las actividades específicas mostradas frente a diversos sustratos y los parámetros cinéticos sugieren que SmaPrx2 y SmaPrx3 tienen funciones específicas en la formación de la pared celular y especialmente en la biosíntesis de ligninas. La caracterización proteómica de estas dos peroxidasas mostró la presencia de varios péptidos procedentes de la digestión tríptica de ambas peroxidasas a través del análisis con MALDI-TOF MS/MS. La presencia en estos péptidos de determinantes estructurales típicos de las peroxidasas siringilo indica que estas proteínas no presentan restricciones estructurales para oxidar restos siringilo. Estos datos, junto con la capacidad de oxidar in vitro el alcohol sinapílico y el bajo KM hallado frente a este alcohol (en el rango ¿M), sugieren que estas dos peroxidasas pueden estar implicadas en la biosíntesis de ligninas siringilo.