Obtención de cepas de "Aspergillus awamori" modificadas genéticamente para la producción de proteínas heterólogas

Resumo

Los hongos filamentosos son ampliamente utilizados para la producción de proteínas heterólogas gracias a su elevada capacidad secretora. En esta Tesis Doctoral se describe el desarrollo de un sistema para la producción en Asperigillus awamori de la proteína taumatina. Esta aparece ne los frutos de la planta tropical Thaumatococcus daniellii y se caracteriza por poseer un sabor 10.000 veces más dulce que la sacarosa, por lo que existen gran interés en su producción industrial. A nivel genético se han utilizado varias estrategias para optimizar la transcripción del gen de la taumatina, como el uso de un gen sintético con uso de codones optimizado para hongos,la fusión con un gén fúngico que codifica para una proteína extracelular eficientemente secretada y la utilización de regiones promotoras fúngicas de alta expresión. Utilizando estas estrategias se observó producción de taumatina por numerosos transformantes, sin embargo ésta era degradada intensamente por proteasas producidas por el hospedador. Mediante mutagénesis al azar se seleccionaron transformantes con menor actividad proteolítica que la cepa silvestre y una de ellas, el mutante Ipr66, mostraba una inserción en el gen pepA, que codifica para la aspergilopepsina A lo que daba lugar a una proteína no funcional. Igualmente, mediante doble recombinación se interrumpió el gen pepB, que codifica para la aspergilopepsina B, obteniéndose cepas con muy baja actividad proteolítica y que daban lugar a elevados rendimientos de taumatina. En las cepas de elevada producción se observó una retención intracelular de tauamtina, lo que indicaba la existencia de un cuello de botella en su secreción. Un aumento moderado de los niveles de proteína disulfuro isomerasa en el retículo endoplásmico incrementó la secreción de taumatina mientras que un aumento superior daba lugar a una reducicón de su secreción por un efecto antichaperón.