Factores implicados en la variabilidad individual en la respuesta a la congelación del eyaculado equinoestructura de subpoblaciones, estrés oxidativo y cambios apoptóticos

Abstract

La mayoría de los estudios que se han hecho en el equino se han centrado en los daños que experimentan los espermatozoides al congelarlos. Sin embargo, nada se ha investigado sobre los factores que intervienen en la gran variabilidad que existe entre sementales con respecto a la capacidad de criotoleracia de sus espermatozoides. La comercialización de semen congelado, se ha visto perjudicada dado que la mayoría de los protocolos se han establecido de forma empírica. Por ello nos propusimos estudiar qué factores están implicados en esta variabilidad y poder posteriormente establecer protocolos individualizados a cada caballo. En nuestro primer trabajo hicimos un estudio de subpoblaciones de eyaculados frescos y posteriormente descongelados cuya finalidad fue analizar sí se producían cambios en la estructura de subpoblaciones. Los datos de motilidad y velocidad espermática se obtuvieron mediante el analisis computerizado de semen (CASA Proiser S.L, Valencia, España) y el análisis estadístico se realizó con un nuevo modulo del SSPS, el Two-step cluster. El proceso de congelación causó un marcado descenso en todas las variables CASA analizadas. Usando las velocidades espermáticas (VCL, VSL, VAP), el análisis de poblaciones diferenció 6 subpoblaciones (S1 y S2: espermatozoides con baja velocidad; S3 y S4: espermatozoides con velocidad media; y S5 y S6: alta velocidad). Tras la descongelación, tan solo se diferenciaron 4 subpoblaciones (FT1-2-3: baja velocidad y FT4 alta velocidad. La estructura de subpoblaciones varió entre sementales antes y después de la congelación. El análisis de poblaciones reveló diferencias entre sementales que no se apreciaban con la estadistica tradicional de esos mismos datos, lo que sugiere que se podría predecir el potencial de congelabilidad de una muestra con este sistema. En el segundo trabajo de la presente tesis, tuvimos por objetivo estudiar la relación existente entre la carga microbiana del eyaculado equino y su capacidad de criotolerancia. Se tomó una muestra antes y después de la congelación para su análisis bacteriológico, observándose crecimiento microbiano en todas las muestras. La presencia de Streptococos ßeta-hemolíticos y Klebsiella spp se correlacionó con la amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH, r= 0.56, p< 0.05) y el porcentaje de células muertas (Ethidio positivas, r=0.62, p<0.05) respectivamente. El crecimiento de Corynebacterium spp se correlacionó positivamente con el porcentaje de espermatozoides con alta actividad caspasa tras la congelación (r=0.62, p<0.05), por tanto, la carga microbiana del eyaculado equino podría ser la responsable de algunos de los daños subletales que experimentan los espermatozoides durante la congelación y explicaría en parte, la variabilidad individual de los eyaculados a la criopreservación. El NO es un radical libre de vida media corta, producido por la oxido nítrico sintetasa (NOS) durante la oxidación de la L-arginina a L-citrulina. En nuestro estudio evaluamos mediante citometría de flujo la producción de NO por parte del espermatozoide, antes y después de congelar, así como la presencia de la NO sintetasa mediante western-blotting. Para ello empleamos anticuerpos anti-NOS1, anti-NOS 3 y un anticuerpo universal de anti-NOS. La producción de NO se detectó tanto en fresco como en descongelado, observándose que su producción se incrementaba tras la congelación únicamente cuando se extraía la yema de huevo del diluyente. Los resultados del western blotting revelaron una única banda de aproximadamente 83 kDa con el anticuerpo anti-NOS 1 y otra de 96 kDa con el anti NOS 3 tanto en semen fresco como en descongelado. La producción de NO se correlacionó positivamente con la motilidad y velocidad post-descongelación, lo que indica el posible papel del NO en la funcionalidad del espermatozoide. Durante la congelación, el espermatozoide sufre un estrés oxidativo como consecuencia de un exceso de producción de radicales libres. Este estrés oxidativo desencadena un proceso similar a la apoptosis que culmina con la muerte o con daños subletales en el espermatozoide. Uno de los daños subletales que se produce es la peroxidación lipídica (LPO) de las membranas. Por ello evaluamos la LPO de las membranas espermáticas antes y después de congelar poniendo especial atención en la diferente susceptibilidad a la LPO y su posible relación con la congelabilidad. Los resultados mostraron niveles basales muy bajos (0.25-1.9%) en semen fresco, aumentando tras la congelación de forma variable según el semental, y no correlacionada con los niveles iniciales. El porcentaje de peroxidación lipídica se correlacionó negativamente con el porcentaje de membranas intactas post-descongelación (r = -0.789, P < 0.001) y con espermatozoides con alto potencial de membrana tras la descongelación (r=-0.689, P< 0.001). La LPO se correlacionó con la actividad caspasa. Por tanto, el espermatozoide equino, aparentemente, parece ser bastante resistente a la LPO, por lo que más que un signo de daño inducido por la congelación, parece ser el desencadenante de cambios similares a la apoptosis, responsable de los daños subletales de los espermatozoides supervivientes. Este fenómeno similar a la apoptosis puede desencadenarse por dos vías, la intrínseca (mitocondrial) o la extrínseca (receptores de muerte). El poro de transición de la permeabilidad mitocondrial (PT), parece tener un importante papel en la vía intrínseca. Con objeto de conocer qué grado de implicación tiene el poro mitocondrial en los cambios que ocurren durante la congelación, usamos un inhibidor específico, el ácido bongkréico (BK), a dos concentraciones 2.5 y 5 µM durante dicho proceso. El BK redujo significativamente el porcentaje de espermatozoides con actividad caspasa post-descongelación, redujo el porcentaje de espermatozoides con incrementó de permeabilidad de membrana e incremento el potencial de membrana mitocondrial de los espermatozoides descongelados. La motilidad espermática se vio reducida tras el tratamiento. Por tanto, la vía mitocondrial de la apoptosis parece ser un factor importante implicado en el daño subletal de los espermatozoides. Además, nuestros resultados indican que el espermatozoide equino parece depender en gran medida del ATP mitocondrial producido por la fosforilación oxidativa.