Recuento y caracterización de clostridium spp. En la ración unifeed y en la leche en relación con las condiciones higiénico-sanitarias y de manejo de las ganaderías de oveja manchega

Résumé

La supervisión y aseguramiento de la calidad de la leche de oveja Manchega es una prioridad en Castilla-La Mancha debido a que ésta es la materia prima para la elaboración del ¿Queso Manchego¿ con Denominación de Origen, producto importante para la región por su contribución al desarrollo socioeconómico. La mejora de la calidad higiénica de la leche contribuye a la prevención de problemas tecnológicos en el queso como la hinchazón tardía. Este problema es una alteración de origen microbiano ocasionada por la presencia en la leche de esporas del género Clostridium. que producen la fermentación del lactato del queso y como resultado provocan defectos de textura y de aspecto por la formación de gas, así como defectos organolépticos, debido a la formación de ácido butírico (Gaggiotti y cols. 2007; Ingham y cols., 1998; Inocente y Corradini, 1996; Klijn y cols., 1995). Las estrategias de control de este defecto que se realizan normalmente a nivel de quesería (Lodi, 1990; Stadhouders y Jorgensen, 1990; Van der Berg y cols., 2004), presentan inconvenientes en su aplicación o no son suficientes para asegurar la ausencia de esporas. Por tanto, es necesario reducir la contaminación de la leche por esporas butíricas a nivel de ganadería. Por ello se plantea este trabajo con el objetivo general de estudiar la contaminación por esporas del Género Clostridium en ganaderías de ovino lechero de la Asociación Nacional de Criadores de Ganado Ovino Selecto de Raza Manchega, en relación con sus características productivas e higiénico-sanitarias. Dicha problemática se aborda desde el punto de vista de la cuantificación de esporas para analizar el grado de contaminación presente en las muestras, como desde el punto de vista de la caracterización de la población de dichas esporas para determinar especies y genotipos de Clostridium spp. presentes en dichas muestras. Para ello, durante un periodo de un año (marzo 2008-marzo 2009), y con una periodicidad de dos meses, se ha recogido un total de 136 muestras de leche de tanque de oveja de raza Manchega y 136 muestras del alimento dispensado a las ovejas de ordeño (ración unifeed) de 23 ganaderías de la Asociación Nacional de Criadores de Ganado Ovino Selecto de Raza Manchega (AGRAMA). Las muestras de leche se han dividido en 2 alícuotas, a una de las cuales se le ha añadido azidiol como conservante siguiendo el procedimiento que deben cumplir los Laboratorios Interprofesionales Lácteos (Real Decreto 1728/2007). En el mismo momento de la recogida de la muestra se ha rellenado una encuesta sobre las características del alimento, las condiciones del alojamiento y la higiene de la sala de ordeño, recopilando los aspectos más relevantes sobre la contaminación butírica según estudios previos realizados en vacuno (Baraton, 1985; Coussi, 1988; Demarquilly, 1998; Vissers y cols., 2006, 2007). La determinación del número de esporas del Género Clostridium fermentadores del lactato se ha realizado mediante la técnica del Número Más Probable (NMP), utilizando el medio Bryant and Burkey Broth (BBB). A partir de los tubos positivos se han obtenido 365 aislados que se han genotipado mediante la técnica Randomly Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) utilizando el cebador M-13. Un representante de cada genotipo se ha identificado mediante la técnica Restriction Analysis of 16S-rRNA gene (16S-ARDRA). Además, se ha comprobado la capacidad de producir gas en medio con lactosa y en medio con lactato de los representantes procedentes de las muestras de leche. Aparte del análisis de esporas de Clostridium spp., en las muestras de leche se ha determinado el recuento de mesófilos totales (RMT), la composición físico-química (grasa, proteína, lactosa y extracto seco), y el recuento de células somáticas (RCS). En las muestras de mezcla unifeed se ha considerado la humedad y el pH. Los resultados obtenidos indican que las ganaderías objeto de estudio mantienen bajos RMT en leche, así como adecuados valores en cuanto a composición físico-química y RCS. Sin embargo, se han obtenido elevados valores medios de recuento de esporas butíricas en la mezcla unifeed (2.378 esporas/g) y en la leche (1.950 esporas/L), así como elevados porcentajes de muestras contaminadas (37,50% de las muestras de mezcla unifeed poseen contaminaciones butíricas >5.000 esporas/g, y 63,97% de las muestras de leche presentan contaminación por esporas butíricas >1.000 esporas/L). La escasa relación encontrada entre RMT y las esporas butíricas señala la inespecificidad del RMT como indicador de calidad microbiológica, a pesar de ser el único índice oficial considerado en la actualidad. Sin embargo, los resultados obtenidos en este trabajo señalan que sería posible integrar el control de la contaminación por esporas butíricas en el estudio de calidad de la leche de oveja por parte de los laboratorios interprofesionales, debido a que los recuentos en las muestras de leche con azidiol no difieren significativamente de los datos obtenidos de la leche sin conservante. Los elevados recuentos de esporas de Clostridium spp. obtenidos en la mezcla unifeed se han relacionado con determinadas prácticas de alimentación seguidas en las ganaderías. La inclusión de ensilados y de cebadilla en la ración de las ovejas de ordeño han resultado ser factores de riesgo de obtener recuentos en la mezcla unifeed superiores a 5.000 esporas/g (valor umbral considerado por Baraton y (1985), Coussi (1988) para estimar la calidad butírica del alimento). Para evitar elevados recuentos de esporas butíricas en la leche, es necesario evitar factores de riesgo relacionados con la alimentación y con la higiene de la explotación. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo, se ha comprobado que se deberían evitar recuentos en la mezcla unifeed superiores a 3.000 esporas/g por el importante aumento del riesgo de obtener recuentos en leche por encima de 1.000 esporas/L (valor umbral establecido por Pirisi y cols. (2007) y Gaggiotti y cols. (2007) para determinar la calidad butírica de la leche). Otros factores de riesgo relacionados con la alimentación son el uso de mezclas unifeed elaboradas en la propia ganadería, y el uso de cebadilla como alimento. En cuanto a las prácticas higiénicas, se ha observado que la acumulación de polvo en la sala de ordeño también ha resultado ser factor de riesgo. Además de la estrecha relación observada entre los recuentos de la mezcla unifeed y de la leche, se ha conseguido establecer la trazabilidad de la contaminación por microorganismos del Género Clostridium mediante la aparición de los mismos genotipos de C. sporogenes en ambos medios. Sin embargo, también se han encontrado poblaciones características tanto en la mezcla unifeed como en la leche. La población de bacterias butíricas de la mezcla unifeed ha estado compuesta por 56 genotipos diferentes pertenecientes a las especies Clostridium sporogenes, Clostridium beijerinkii y Clostridium butyricum; mientras que la población en la leche ha estado formada por 35 genotipos de las especies Clostridium sporogenes, Clostridium beijerinkii y Clostridium tyrobutyricum. También se ha observado que los factores de riesgo relacionados con el aumento de esporas butíricas en la mezcla unifeed y en la leche determinan la población de Clostridium spp. En las muestras de mezcla unifeed, el uso de ensilado y de cebadilla se han relacionado con la presencia de C. beijerinkii y C. butyricum; en el caso de las muestras de leche, el tipo de mezcla unifeed, el uso de cebadilla, y alto nivel de polvo en la sala han determinado la presencia de C. beijerinkii y C. tyrobutyricum. Estas especies además destacan por su elevada producción de gas, convirtiéndolas en peligrosas para la aparición de la hinchazón tardía en el queso. En consecuencia, los ganaderos de ovino lechero deberían aplicar prácticas apropiadas de alimentación e higiene debido a su influencia sobre el grado de contaminación y tipo de población de Clostridium spp. Para favorecer su aplicación estos criterios podrían incluirse en los sistemas de pago por calidad, reduciéndose por tanto el problema de la Hinchazón Tardía en los quesos madurados. BIBLIOGRAFÍA BARATON, Y. 1985. La contamination du lait par les spores butyriques. Le Point Sur. Edite par L¿Institut Technique de L¿Elevage Bovin, 32. COUSSI, G. 1988. Butyriques et fermentation butyrique. Dossiers Techniques Veterinaires (Juillet): 75-96. GAGGIOTTI, M., ROMERO, L.A., CALVHINO, M.V. 2007. Presencia de clostridios gasógenos en la leche. Calidad de leche y productos. IdiaXXI, año VII, 9: 143-149. INGHAM, S.C., HASSLER, J.R., TSAI, Y., INGHAM, B.H. 1998. Differentiation of lactate-fermenting, gas-producing Clostridium spp. isolated from milk. 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