Paratuberculosis en españaimportancia de los reservorios silvestres

Resumen

Paratuberculosis en España: importancia de los reservorios silvestres Esta tesis aborda el papel de los animales silvestres en relación con la paratuberculosis en la península ibérica bajo la hipótesis de que, debido a su alta densidad poblacional de ciervos, la paratuberculosis podría ser detectada en un elevado número de ciervos ibéricos. Además, otras especies, como los jabalies, los conejos o los carnívoros, también podrían constituir indicadores de circulación de paratuberculosis. En concreto, se plantean los siguientes objetivos: 1. Actualizar todas las informaciones vigentes sobre paratuberculosis en fauna silvestre 2. Optimizar los métodos de diagnóstico de paratuberculosis para su aplicación a fauna silvestre. 3. Estudiar el papel de la fauna silvestre española como reservorio de paratuberculosis. 4. Caracterizar la diferencia de expresión de genes relacionados con la inmunidad en ciervos y bóvidos infectados con M. bovis y Anaplasma marginale. La tesis se estructura en cinco capítulos. El primero de ellos es una revisión bibliográfica sobre la paratuberculosis en la fauna silvestre, que permite evaluar el estado actual de conocimientos sobre su posible implicación en el mantenimiento de MAP, su efecto sobre sus poblaciones, y las consecuencias de paratuberculosis sobre la vigilancia sanitaria de otras micobacteriosis, particularmente la tuberculosis. Los siguientes tres capítulos describen el papel del conejo como posible reservorio local de paratuberculosis en la península ibérica; la ausencia de utilidad de los cánidos ibéricos (lobo y zorro) como posibles centinelas de la circulación de MAP; y el hecho de que, contrariamente a lo esperado, el ciervo no constituye un reservorio de paratuberculosis en el área de estudio. El quinto y último capítulo analiza la expresión de genes relacionados con la inmunidad en respuesta a la infección de rumiantes por patógenos de los géneros Anaplasma y Mycobacterium. Capítulo 1 En la revisión bibliográfica que constituye el capítulo 1 de esta tesis se recopila la información existente sobre paratuberculosis en animales silvestres y su diagnóstico. Esta revisión demuestra que MAP circula en casi todo el mundo, entre diferentes vertebrados silvestres. De todas las especies estudiadas, solamente cinco son considerados como reservorios, incluyendo varios rumiantes como el ciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus) en Norteamérica, ciervo (Cervus elaphus) y corzo (Capreolus capreolus) en los Alpes, y gamo (Dama dama) en Asturias, y el conejo (Oryctolagus cuniculus) en Escocia y, probablemente, en Nueva Zelanda, España y República Checa. La literatura sobre cérvidos y conejos sugiere que puedan participar en la epidemiología de MAP, pero siempre dependiendo de la región geográfica. La excreción de MAP por parte de los animales silvestres es menor que la excreción por bovinos clínicamente afectados. No obstante, el principal reservorio mundial de MAP lo constituyen los propios rumiantes domésticos, por lo que el papel de los rumiantes silvestres como reservorio tendría una relevancia muy local, en lugares donde los rumiantes domésticos sean objeto de control y coexistan con un reservorio silvestre. En ningún caso los investigadores han llegado a concluir que la paratuberculosis constituya un factor limitante para la dinámica de una población silvestre. Los principales problemas se relacionan con animales en cautividad (por ejemplo en granjas de ciervo) o con animales expuestos a una elevada contaminación ambiental por MAP con origen en los rumiantes domésticos. En cambio, sí es importante la reacción cruzada entre antígenos del complejo M. avium y antígenos del complejo M. tuberculosis (en pruebas serológicas) y la falta de especificidad en PCR y en patología. Estos problemas son debidos a las similitudes entre MAP y otras micobacterias, incluyendo a miembros del complejo M. tuberculosis como M. bovis, agente causal de la tuberculosis bovina. En consecuencia, MAP puede comprometer el diagnóstico y control de la tuberculosis, por ejemplo en ciervos de granja o en traslados de fauna silvestre. Igualmente, MAP limita la utilidad del diagnóstico de las micobacteriosis en la fauna silvestre mediante pruebas de detención de anticuerpos. Esto coincide con cuanto ocurre en el ámbito de los rumiantes domésticos, donde es sabido que la infección por MAP puede limitar la especificad y la sensibilidad de las pruebas de tuberculosis y por lo tanto afectar a las campañas de erradicación de tuberculosis. Capítulo 2 La paratuberculosis, es una enteritis crónica compartida entre el ganado doméstico y fauna silvestre. Además de numerosos rumiantes silvestres, también el conejo puede actuar como reservorio de MAP. No obstante, apenas se conoce el papel epidemiológico del conejo en relación con MAP fuera de Escocia. En el capítulo 2, a través de la biología molecular y la histopatología, se ha evidenciado la presencia de MAP en conejos del Sur Europa y se ha desarrollado una prueba ELISA indirecta para la detención de anticuerpos específicos frente a MAP. Este trabajo también describe las diferentes formas patológicas presentes en conejos (Oryctolagus cuniculus) con paratuberculosis. Se han muestreado 80 conejos del sur de España, y sueros de 157 conejos más, provenientes de otros 7 lugares. Se han inmunizado 4 conejos domésticos mediante inoculación de un antígeno específico (Paratuberculosis Protoplasmátic Antigen 3, PPA3), al fin de disponer de controles positivos en la prueba ELISA. Se utilizaron sueros de conejos de granja sin contacto con MAP como controles negativos, al fin de establecer un punto de corte. Eligiendo el punto de corte de 0,5 de densidad óptica (OD), se identificaron como positivos con la prueba ELISA 6 de los 237 sueros de conejos silvestres testados (2,5%). Se detectaron anticuerpos específicos anti-MAP en conejos provenientes de 3 de las 8 áreas de estudio. En la necroscopia, 2 de 80 conejos presentaron lesiones macroscópicas compatibles con paratuberculosis. La histopatología reveló presencia de paratuberculosis con lesiones que iban de focales hasta multibacilares en 8 de los 10 conejos examinados. La presencia de MAP fue confirmada mediante RT-PCR en un conejo con lesiones macroscópicas, evaluando la curva de amplificación de los fragmentos IS-900 e ISMAP02. Por lo tanto, en este estudio, se ha confirmado por primera vez la infección y la clínica en conejos silvestres del sur de Europa, y se ha comprobado que el contacto del conejo silvestre con MAP está muy extendido. Considerando la creciente importancia de MAP en la salud animal, estos resultados abren nuevas ventanas para futuras investigaciones. Capítulo 3 Los carnívoros silvestres siendo predadores y tal vez carroñeros tienen más posibilidades de entrar en contacto con agentes patógenos contaminantes del medio ambiente o presentes en animales. Por ello, en el capítulo 3 de esta tesis hemos partido de la hipótesis de que los cánidos silvestres pueden ser usados como centinelas en áreas con alta prevalencia de MAP en fauna silvestre y doméstica. Para comprobar esta hipótesis se muestrearon, entre 2004 y 2009, 24 lobos (Canis lupus) y 285 zorros (Vulpes vulpes) procedentes de distintas regiones peninsulares. En el laboratorio los cadáveres fueron necropsiados, y las muestras conservadas en congelación y en formol para histopatología. En la necropsia no se detectaron lesiones compatibles con MAP. Se adaptó un ELISA indirecto para la detención de anticuerpos frente a MAP en suero, procesando también un pool de muestras para cultivo (n=61) y analizando 15 muestras mediante PCR especifica para MAP y 14 para histopatología. Los resultados obtenidos muestran como los cánidos silvestres no sean útiles como centinelas de paratuberculosis para la vigilancia sanitaria en el suroeste de Europa. Capítulo 4 En el capítulo 4 hemos analizado mediante estudio anatomopatológico, cultivo y serología, muestras provenientes de 332 ciervos (Cervus elaphus) cazados en distintas regiones de la península ibérica. Entre 2005 y 2009 hemos podido obtener muestras de 332 ciervos. Éstos animales se inspeccionaron en busca de lesiones macroscópicas compatibles con tuberculosis. Se tomaron muestras de los linfonodos de la cadena mesentérica, incluyendo el linfonodo ileocecal, así como la válvula ileocecal para histopatología. Un pool de linfonodos mesentéricos se utilizó para cultivo. La histopatología reveló solamente tres animales (1.12%) que mostraban lesiones focales compatibles con paratuberculosis en el área interfolicular del tejido linfoide intestinal. En estas lesiones no se encontraron organismos ácido-alcohol resistentes en las tinciones de Ziehl Neelsen. Se encontraron lesiones compatibles con tuberculosis en 25 animales (8.4%). No se observó crecimiento de MAP en cultivo. En ELISA, las densidades ópticas en placas antigenadas con ¿Paratuberculosis Protoplasmatic Antigen 3¿ (PPA3) y ¿bovine Purified Protein Derivative¿ (bPPD), respectivamente, estaban significativamente correlacionadas. Ello sugiere una reacción cruzada y, por lo tanto, una falta de especificad del test. Los resultados obtenidos contrastan con la situación descrita en otras regiones, y permiten descartar al ciervo como reservorio de paratuberculosis en el área de estudio. Los únicos ciervos significativamente afectados por la paratuberculosis serían por tanto los ciervos de granja. Capítulo 5 Los patógenos de los géneros Anaplasma y Mycobacterium figuran entre los patógenos bacterianos más prevalentes en el ciervo (cervus elaphus) del suroeste de España. Se sabe que estos patógenos modifican la expresión génica en los rumiantes. En este trabajo, que conforma el capítulo 5 de esta tesis, hemos utilizado la hibridación con microarray y la RT-PCR en tiempo real para caracterizar el perfil global de la expresión génica en el ciervo en respuesta a las infecciones por Anaplasma ovis y A. ovis/M. bovis/ MAP; comparar la expresión génica de la respuesta inmune en ciervos infectados con A. ovis, M. bovis y A. ovis/M. bovis/MAP, así como para caracterizar la diferencia de expresión de genes relacionados con la inmunidad en ciervos y bóvidos infectados con M. bovis y Anaplasma marginale. Globalmente, la expresión diferencial de genes en ciervos infectados con A. ovis y A.ovis/M. bovis/MAP resultó en la modificación de procesos biológicos celulares comunes y específicos para estos patógenos. La expresión diferencial de genes relacionados con la inmunidad del hospedador mostró patrones característicos de la respuesta del hospedador al patógeno, así como el efecto de la infección con múltiples patógenos en la respuesta inmune del ciervo. Estas diferencias específicas del patógeno y del hospedador podrían contribuir a mejorar el diagnóstico de las enfermedades causadas por Anaplasma y Mycobacterium, así como su control en rumiantes. En resumen, esta tesis doctoral aporta una buena base y una valiosa información en el estudio epidemiológico de esta enfermedad, proporcionando una gran ayuda para la prevención y control de la paratuberculosis.