Diseño de un medio definido para la maduración in vitro de ovocitos bovinos en baja tensión de oxígeno

Resum

La producción de embriones bovinos in vitro (PIV) representa, en la actualidad, una alternativa frente a las técnicas convencionales de obtención de embriones in vivo. Sin embargo, esta técnica es aún poco eficiente lo que dificulta su utilización a escala comercial. Las condiciones a las que son sometidos a los gametos, especialmente en la fase de maduración, y los embriones durante la PIV condicionan los resultados finales. Por tanto, para incrementar la eficiencia de la PIV es necesario empezar por la maduración in vitro aclarando los mecanismos que la controlan y mejorar las condiciones del cultivo al objeto de que se desarrolle con la máxima normalidad. Nuestra hipótesis de trabajo es que utilizando el mismo medio básico y la misma atmósfera gaseosa durante todas las etapas del proceso (maduración, fecundación y cultivo) y eliminando las sustancias de origen biológico, podremos obtener unos resultados más homogéneos y unos embriones de mayor calidad. Para lograrlo, hemos sustituido las fuentes proteicas utilizadas de manera habitual, cuya composición es indefinida y variable (FCS y BSA) por una macromolécula sintética (PVP-40) (Exp 1). Para este experimento se realizaron 4 replicados usando un total de 622 CCO que fueron madurados en SOF suplementado con cada una de las macromoléculas consideradas. El análisis estadístico de los resultados demostró que no había diferencias estadísticamente significativas ni en la tasa de división ni en el número de blastocistos obtenidos tras 8 días de cultivo entre los tres tratamientos considerados. En el segundo experimento (Exp 2), se determinó el efecto de diferentes concentraciones de glucosa (1,5; 5,6 y 10 mM) en un medio simple libre de proteínas y en una atmósfera gaseosa con un 6% de O2, durante la maduración de los ovocitos, evaluando la evolución nuclear y la producción de blastocistos. Para ello se emplearon 2008 CCOs, que maduraron en SOF suplementado con tres concentraciones diferentes de glucosa, 1,5 mM (509 CCO), 5,6 mM (488 CCO) y 10 mM (510 CCO), así como en un grupo control (501 CCO). Los resultados obtenidos indican que cuando la maduración se produce con una concentración de O2 del 6% la evolución nuclear está condicionada por la concentración de glucosa. Así, cuando la concentración de glucosa presente en el medio de maduración era 10 mM, los porcentajes de división y producción de blastocistos fueron semejantes a los obtenidos al utilizar el medio control. Posteriormente se evalúo la posibilidad de substituir las hormonas de origen biológico, cuya presencia provoca la indefinición del medio, por otras sustancias de composición conocida. Así se evalúo el empleo del EGF (Exp3), mediante el cultivo de un total 840 COCs (5 réplicas), que fueron asignados al azar a cada uno de los tres tratamientos considerados: mSOF-Hormonas (n=293), mSOF-EGF (n=281) y mSOF (n=266). El análisis estadístico de los resultados indicó un mayor porcentaje de blastocistos totales en el grupo cultivado en un medio de maduración suplementado con hormonas (26,47%) frente a los grupos en los que se incorporó EGF o no se utilizó ningún suplemento (19,57 y 18,17% respectivamente), pero las diferencias en los porcentajes de blastocistos eclosionados a los 10 días p.i. carecían de significación estadística. También se evaluó el efecto del empleo de diferentes concentraciones de FSH humana recombinante (r-hFSH) (1, 0.5 y 0.01 UI frente a control; Exp 4) y de la duración del período de maduración (24, 28 y 32 horas; Exp 5). El análisis estadístico de los resultados indicaba que la utilización de r-hFSH a una concentración de 1 UI/mL de permite lograr tasas de división, de blastocistos y de eclosión similares a las obtenidas empleando la combinación de hormonas naturales utilizada de manera habitual. Cuando evaluamos el efecto de la duración del periodo de maduración comprobamos que al prolongarlo más de 24 horas los resultados no mejoraban. En el último ensayo se evaluó el efecto de utilizar una concentración del 6% de O2 durante el cocultivo de los espermatozoides y los ovocitos bovinos, frente al 20% de O2 utilizado de manera habitual. Para ello se han realizado 4 réplicas con un total de 883 CCO. Nuestros resultados demostraron que los porcentajes de división a las 48 horas y de blastocistos en los días 7 y 8, de blastocistos totales y eclosionados eran superiores en el grupo de ovocitos fecundados en 6% de 02. Además, en el caso de los blastocistos de día 8 y eclosionados las diferencias eran estadísticamente significativas (p<0.01). Todo ello nos permite afirmar que es posible utilizar una misma atmósfera gaseosa durante todas las etapas del proceso (maduración, fecundación y cultivo) y sustituir las sustancias de origen biológico por PVP-40 y r-hFSH sin que ello provoque ningún efecto negativo sobre la producción de blastocistos ni la calidad de los mismos.