Caracterización y resistencia a antimicrobianos de aislados españoles de "Glaesserella parasuis". Valoración de la eficacia de una vacuna frente a la enfermedad de Glässer basada en una TbpB (proteína de unión a la transferrina) modificada

Abstract

La industria porcina enfrenta importantes desafíos económicos, siendo la enfermedad de Glässer uno de los más relevantes. Esta enfermedad está causada por Glaesserella (Haemophilus) parasuis, patógeno que coloniza el tracto respiratorio superior de los cerdos y, en condiciones de estrés como el destete o el transporte, puede desencadenar infecciones sistémicas graves. Los lechones en las primeras etapas de lactancia y engorde son especialmente vulnerables, lo que genera altos índices de morbilidad y mortalidad. Esta bacteria adquiere hierro de la transferrina porcina mediante un receptor de superficie compuesto por las proteínas de unión a la transferrina TbpA y TbpB, lo que facilita su supervivencia en entornos con baja disponibilidad de hierro, como las superficies mucosas. Sin embargo, los mecanismos de virulencia de esta bacteria aún no se comprenden completamente y el desafío se agrava por el preocupante aumento de la resistencia a los antimicrobianos, impulsado por su uso intensivo en la producción porcina. Este doble problema pone de manifiesto la urgencia de profundizar en la investigación sobre los factores de patogenicidad de G. parasuis y de desarrollar estrategias que permitan reducir el uso de estos medicamentos sin comprometer el control de la enfermedad. Este fenómeno compromete la efectividad de los tratamientos y plantea un riesgo adicional de transmisión de genes de resistencia a otras bacterias en el entorno. Sin embargo, ante la ausencia de una vacuna universal comercialmente disponible para prevenir esta enfermedad, el tratamiento con antimicrobianos sigue siendo la principal estrategia de control, a pesar de los desafíos asociados. Esto subraya la necesidad de desarrollar herramientas de diagnóstico precisas, fomentar un uso responsable de los antimicrobianos y promover investigaciones que permitan avances en el diseño de vacunas eficaces y de amplio espectro. El objetivo principal de esta tesis doctoral es realizar una caracterización detallada de la virulencia y los perfiles de resistencia a antimicrobianos de aislados de G. parasuis presentes en explotaciones porcinas españolas. Paralelamente, se busca analizar la diversidad genética de la proteína TbpB en estos aislados, con el propósito de evaluar la eficacia de una vacuna recombinante basada en TbpB frente a una variedad de serovares clínicos representativos de la enfermedad de Glässer en España. En primer lugar, se analizaron 68 aislados clínicos de G. parasuis recolectados entre 2018 y 2021 en diversas regiones de España, provenientes de muestras respiratorias y sistémicas de cerdos. Para su caracterización, se utilizó una PCR específica del gen tbpA y una PCR multiplex para identificar los serovares presentes. Los serovares 5, 10, 2, 4 y 1 resultaron ser los más comunes, abarcando aproximadamente el 84 % de los aislados, lo que pone de manifiesto su alta prevalencia en el país. A continuación, se llevó a cabo un análisis de las secuencias de aminoácidos de la proteína TbpB en 59 de estos aislados, que permitió clasificar las cepas en diez clados distintos. Este hallazgo refleja una notable diversidad genética entre las cepas, que se relaciona tanto con los tipos capsulares como con los diferentes orígenes anatómicos y geográficos de los aislamientos. Con el fin de caracterizar la virulencia de los aislados, se evaluó la virulencia mediante PCR multiplex de secuencia líder de los genes vtaA, y todos los aislados se identificaron como clínicos (presuntamente virulentos). El patotipado basado en diez genes del pangenoma reveló que el gen virulento HPS_22970 era el más frecuente (83,1%). Se observaron diversos perfiles de patotipo, con 29 combinaciones génicas únicas y dos aislados portadores únicamente de genes del pangenoma potencialmente no virulentos. Posteriormente, se analizaron los perfiles de resistencia a antimicrobianos de los aislados, obteniendo una resistencia generalizada en el fenotipado de resistencias antimicrobianas, con un 63,3% clasificado como multirresistente, y una alta resistencia a la clindamicina (98,3%) y la tilosina (93,3%). Se encontró una asociación estadísticamente significativa entre ciertos genes de patotipos y fenotipos de resistencia a antimicrobianos, en particular entre el gen virulento HPS_22970 y la resistencia a la tetraciclina (p < 0,001). Por último, en este estudio se evaluó en dos fases la inmunogenicidad y protección de una vacuna oral de dos dosis, basada en una TbpB modificada (TbpBY167A) en lechones privados de calostro. En la primera fase (días 0-45), se analizó la respuesta inmunitaria, y en la segunda (días 45-52), la protección heteróloga tras desafiar a los lechones con cuatro aislados clínicos de G. parasuis de diferentes serovares. La vacuna indujo una respuesta inmune robusta, con un aumento significativo de IgA e IgM. Tras el desafío, se observó una mejora en las tasas de supervivencia y una reducción en los signos clínicos y las lesiones, independientemente del serovar. Además, la vacuna redujo la colonización en el tracto respiratorio y en tejidos sistémicos, como las articulaciones, el hígado y el cerebro. El análisis inmunohistoquímico reveló un menor número de macrófagos en los pulmones de los lechones inmunizados. Los hallazgos de este estudio destacan la variabilidad genética de G. parasuis y su compleja patogenicidad, evidenciando la necesidad de caracterizar de manera precisa los aislados clínicos para asegurar tratamientos antimicrobianos adecuados y medidas profilácticas efectivas contra las cepas virulentas. A pesar de la diversidad genética observada en los serovares, los hallazgos in silico sugieren que una vacuna basada en la proteína TbpB podría ofrecer una protección amplia contra los brotes de la enfermedad de Glässer en España, destacando su potencial como herramienta de control en la industria porcina. En cuanto al estudio in vivo, la administración oral de la vacuna de subunidad TbpBY167A en lechones ha demostrado ser eficaz, brindando protección heteróloga frente a diferentes aislados virulentos, reduciendo significativamente la colonización bacteriana y la diseminación en los tejidos. Este enfoque supera las limitaciones de las vacunas tradicionales al contrarrestar los efectos de la inmunidad materna, convirtiéndola en una alternativa prometedora para la vacunación universal contra la enfermedad de Glässer.