Role of the nitric oxide system in different reproductive processes

Resumen

El óxido nítrico (NO) regula los procesos fisiológicos y patológicos en diferentes sistemas orgánicos, incluido el sistema vascular, nervioso y reproductor. Su síntesis tiene lugar a partir del precursor L-Arginina, gracias a la familia de enzimas Óxido Nítrico Sintasa (NOS). Esta familia se encuentra formada por dos enzimas constitutivas, la NOS endotelial y la neuronal (eNOS, nNOS), y una inducible (iNOS). Los principales objetivos de esta tesis fueron estudiar el efecto del NO sobre la capacitación espermática en dos especies diferentes y determinar si los niveles de NO en el líquido folicular (FF) pueden predecir los resultados clínicos de las Técnicas de Reproducción Asistida. Para ello, en primer lugar, se analizó cómo la adición de NO o la inhibición de su síntesis afectaba a la capacitación espermática y a la fecundación in vitro (FIV) en la especie porcina (Capítulo 1). Posteriormente, se estudió cómo la fosforilación de las proteínas es modulada por el NO, L-Arginina y el FF durante la capacitación en espermatozoides humanos (Capítulo 2). Finalmente, se determinaron los niveles de NO en el FF y su relacion con la calidad de los ovocitos en mujeres (Capítulo 3). En el primer capítulo se describió la localización de las tres isoformas de la NOS en espermatozoides mediante inmunocitoquimica. Tanto la eNOS como la nNOS se ubicaron en la región de la cabeza espermática, con una señal débil en la pieza principal y final de la cola. Sin embargo, la iNOS mostró una distribución más general. En relación a: motilidad, sustratos de fosfo-PKA, fosforilación en tirosina, reacción acrosomal, translocación de fosfatidilserina y concentración del calcio intracelular, se observó que eran modificados por la presencia o ausencia de NO. Para estos análisis se utilizó el donante de NO, S-Nitrosoglutatión (GSNO), y dos inhibidores de las NOS, NG-Nitro-L-Arginina Metil Éster (L-NAME) y Aminoguanidina (AG). A tiempo 0 la motilidad no se vio afectada por los tratamientos utilizados. Sin embargo, a los 30 minutos se observó que la velocidad rectilínea (VSL) y la velocidad media (VAP) disminuyen en presencia de AG. La inhibición de NOS disminuyó el grado de fosforilación de tres sustratos de la PKA (~ 75, ~ 55 y ~ 50 kDa) aunque fosforilación de tirosina no difirió entre los tratamientos. El inhibidor L-NAME hizo disminuir el porcentaje de espermatozoides reaccionados y la exteriorización de la fosfatidilserina. L-NAME y AG indujeron una disminución en la concentración intracelular de calcio. En segundo lugar, se evaluó el papel del NO sobre la interacción de gametos en presencia o ausencia de células del cumulus. Se observó que tanto la adición del L-NAME como del AG durante la FIV, producía un descenso en el porcentaje de ovocitos penetrados cuando éstos se encontraban rodeados por las células del cumulus. No obstante, al eliminar éstas células la penetración disminuyó aún más, llegando a ser nula en presencia del inhibidor L-NAME. En el Capítulo 2, se analizó el papel de la L-Arginina y del FF sobre la fosforilación en serina, treonina y tirosina en espermatozoides de hombres y si su efecto se veía modificado por la presencia de donante de NO o por los inhibidores de síntesis de NO. Se observó que cuatro bandas de proteínas de ~ 110, ~ 87, ~ 75 y ~ 62 kDa disminuían la intensidad de fosforilación en presencia de inhibidores de las NOS, tanto en presencia como en ausencia de L-Arginina o FF. Posteriormente se identificaron que proteínas eran las afectadas y se observó que 29 de ellas estaban relacionadas con diferentes procesos reproductivos: espermatogénesis, unión a la zona pelúcida, metabolismo energético, respuesta al estrés, la motilidad y estructura, y señalización y recambio de proteínas. En el estudio final (Capítulo 3), se determinó la relación entre el nivel de nitrito (NO2) y nitrato (NO3) en el FF de mujeres que participaron en un programa de donación de gametos y la calidad de sus ovocitos. Se observó que ni el número total de ovocitos recogidos ni el de ovocitos MII se asociaron con los niveles de NO2 y NO3 en el FF. Sin embargo, la proporción de ovocitos MII sí que se relacionó directamente con los niveles de NO2 e inversamente con los niveles de NO3. Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral muestran la importancia del NO sobre los gametos y su interacción. En relación al espermatozoide porcino, se observó que la localización de las isoformas de la NOS es diferente y que la inhibición de la síntesis de NO disminuye los parámetros que participan en el proceso de capacitación y la penetración de ovocitos. En relación a los espermatozoides del hombre, se determinó que al inhibir la producción de NO se produce una disminución de la fosforilación de proteínas relacionadas con la función reproductiva y este efecto no se revierte por la presencia de L-Arginina o FF. Además, la síntesis de NO en el FF de mujeres donantes de ovocitos sometidas a tratamiento de superovulación, se relaciona con el porcentaje de ovocitos maduros, pero no con la cantidad total de ovocitos recuperados tras el tratamiento.