Diseño y evaluación de test rápidos para la detección de antibióticos y sulfamidas en carne

Resumen

En las últimas décadas, la seguridad alimentaria se ha convertido en una de las prioridades de las autoridades sanitarias europeas y de los propios consumidores. Los principales problemas sanitarios originados por el consumo de alimentos son los causados por la presencia de microorganismos patógenos y los residuos de insecticidas y drogas de uso veterinario que éstos pueden vehicular. Tras la utilización de productos terapéuticos es necesario respetar un periodo de supresión antes del sacrificio de los animales para garantizar la eliminación de los residuos de sus tejidos por debajo de los límites máximos establecidos legalmente. De no ser así, existe un riesgo elevado de que los residuos de medicamentos o sus metabolitos persistan en el animal en el momento del sacrificio, llegando a la cadena de alimentación humana. Por otra parte, la detección de antibióticos en alimentos es un problema antiguo que en la actualidad permanece sin resolver de una forma adecuada. La diversidad química de este amplio grupo de fármacos hace que resulte inviable en la práctica el desarrollo de un protocolo de análisis químico sistemático, dado el elevado número de muestras a analizar y la diversidad de técnicas analíticas precisas para su adecuado control. Aunque en los últimos años se han producido importantes mejoras y simplificaciones de los equipos necesarios para este tipo de análisis químicos, básicamente el problema práctico sigue siendo el mismo: la necesidad de técnicas de cribado rápidas que permitan discriminar un elevado número de muestras. Los test de cribado utilizados son en su mayoría de base biológica, y en general se basan en detectar el efecto inhibidor de una muestra de alimento sobre el crecimiento de una especie microbiana de referencia, cultivada en un medio adecuado. En los últimos años se han desarrollado test comerciales en formato de placas microtiter que han facilitado enormemente la realización de este tipo de análisis, como por ejemplo en el sector lácteo, si bien es cierto que no son aplicables a todas las matrices alimentarias, como por ejemplo en el sector cárnico, donde los esfuerzos por adaptar los test comerciales del sector lácteo no han dado buenos resultados. Esta investigación se inició con el objetivo de contribuir a un mejor control de la calidad y seguridad de la carne y los productos cárnicos mediante el diseño de un test rápido de detección de antibióticos y sulfamidas, útil tanto a nivel de laboratorio como de granja, que pudiera comercializarse listo para su uso y ser utilizado por personal sin capacitación técnica previa. Por otra parte, pretendíamos también poner a disposición de los interesados un protocolo de análisis de residuos de antibióticos y sulfamidas en carnes, semejante al actualmente utilizado en el sector lácteo, que fuera rápido, fiable y de bajo coste, de forma que facilitase la aplicación del Plan Nacional Integrado de residuos (P.N.I.R.) y, por tanto, contribuyese a proteger la salud pública. Para ello, y dada la imposibilidad de adquirir, por su inexistencia, muestras contaminadas de referencia, decidimos, como primer paso, crear un banco de muestras. Este banco se creó a partir de un lote de corderos que se ¿blanquearon¿ durante un mes y posteriormente se inocularon, en lotes de cinco animales, con cada uno de los antibióticos. Tras aplicar las dosis terapéuticas prescritas, cada uno de los cinco corderos se sacrificaron tras distintos días de supresión. Posteriormente se despiezaron las canales, se envasaron a vacío las piezas y se congelaron para su conservación. Ello nos permitió conseguir muestras contaminadas con distintas concentraciones de cada antibiótico. Para la comparación del prototipo necesitaríamos utilizar un método de referencia. Decidimos utilizar para ello el ¿Test de las 4 placas¿, recomendado por la Unión Europea. Desafortunadamente existe muy poca bibliografía científica sobre la eficacia del test y la influencia sobre su comportamiento de los distintos factores ambientales. Decidimos por ello hacer un estudio exhaustivo sobre su comportamiento y los factores que lo afectaban; de hecho, en algunas circunstancias incluso intentamos mejorar su comportamiento. Quizás nuestra aportación más importante en este apartado, fuera de los objetivos inicialmente planteados, es que estudiamos la respuesta a cada uno de los antibióticos de cada una de las placas, aspecto sobre el que existen muy pocos datos. Posteriormente pasamos al diseño y desarrollo del test de detección de antibióticos. Las investigaciones fueron reorientándose durante el desarrollo de los trabajos, a veces como consecuencia de los resultados obtenidos, a veces por sugerencia de la industria colaboradora, con la consecuencia de que realmente diseñamos distintos prototipos cada uno con sus particularidades específicas. Todos tienen en común que la especie testigo es G. stearothermophilus y que el indicador del metabolismo es púrpura de bromocresol. El prototipo I fue diseñado con una fase líquida inoculada con el microorganismo testigo y donde se puede añadir como muestra un trocito de carne, y una fase sólida que actúa como filtro permitiendo ver unos virajes claros e incluso una lectura espectrofotométrica. Su principal inconveniente es que el tiempo de análisis es relativamente largo (unas 5 horas), por el retraso adicional que supone la migración de los hidrogeniones al medio sólido. El prototipo II (test Gold), consta únicamente de una fase líquida donde se deposita la muestra de suero. En realidad también aquí se diseñaron diversas variantes que permitían distintos tipos de muestreo: añadir directamente unas gotitas de suero extraídas por calentamiento de la carne, añadir discos de papel impregnados con el suero, añadir hisopos empapados con el suero al ser introducidos en un pequeño corte de la pieza de carne, etc. En cualquiera de estas modalidades se podían detectar la mayor parte de las sustancias antibacterianas a concentraciones próximas al LMR o ligeramente superiores. El test es, comparado con la competencia, especialmente bueno para la detección de tetraciclinas y sulfamidas. El tiempo de análisis es razonablemente rápido, alrededor de 3 horas, con un viraje claro. Tras definir el industrial la variante de test que más se ajustaba a sus deseos, procedimos a realizar los últimos ajustes y a definir las condiciones de producción. Se elaboraron los primeros test en la industria y procedimos a hacer los controles de calidad y estabilidad del producto. Como paso previo a su posible comercialización, se llevó a cabo un estudio interlaboratorial en el que participaron 5 laboratorios que representaban a los distintos sectores que podrían estar interesados en el test. Este estudio sirvió, junto con los datos anteriores, para la redacción del informe técnico del producto. Finalmente diseñamos un protocolo de análisis de residuos que incluía como método de cribado al test Gold y otros dos diseñados paralelamente por la empresa. Para comprobar la validez/utilidad del protocolo y para tener datos sobre la incidencia real de antibióticos en carne, decidimos hacer un estudio adicional. En el estudio participaron cinco laboratorios de ámbitos distintos coordinados por el nuestro. En el estudio se analizaron 1280 muestras de aves, 1283 de ovino, 1302 de bovino y 984 de porcino; en otra palabras, casi 5000 muestras, lo que le hace ser, que nos conste, el más amplio realizado hasta la fecha. Al margen de los resultados concretos, que se incluyen en el texto, el trabajo demostró que el Test de las 4 placas recomendado por la UE, no es un buen test de cribado, pues apenas hubiese detectado la mitad de las muestras positivas. Por otra parte, el estudio de campo puso de relieve que el número de muestras positivas es mayor que el que se desprende del P.N.I.R., lo que parece lógico dado que la metodología que utiliza no es la adecuada, y que el protocolo de análisis con cribado y preidentificación mejoraría mucho los actúales sistemas de análisis.