Eficiencia del aislador genómico del locus de la b-globina de pollo en cultivos primarios de fibroblastos fetales ovinos

Resumen

Los aisladores genómicos o insulators son secuencias de ADN caracterizadas en algunos loci que protegen a los genes de señales inadecuadas procedentes de su entorno genómico, creando dominios de expresión funcionalmente independientes. Algunos poseen la capacidad de evitar el avance de la heterocromatina hacia zonas transcripcionalmente activas (actividad barrera), protegiendo así a los genes frente a los efectos de posición. El aislador cHS4 del locus de la ß-globina de pollo posee esta actividad y es uno de los mejor caracterizados en vertebrados. Dado que no todas las regiones del genoma son igualmente permisivas para la expresión génica y puesto que los efectos de posición pueden conducir al silenciamiento parcial o total de la expresión, el uso de aisladores genómicos puede resultar de gran interés para mejorar la expresión de transgenes. El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral se centró en evaluar la actividad barrera de la secuencia core del aislador cHS4 en cultivos primarios de fibroblastos fetales ovinos, células de elección para los experimentos de transgénesis y transferencia nuclear en animales de granja. Previamente, se llevó a cabo la caracterización de cultivos primarios de fibroblastos fetales ovinos obtenidos a partir de ovejas de raza Cara Negra Escocesa (Scottish Black Face, SBFF), analizando su cariotipo, cinética de crecimiento y capacidad de diferenciación. En este sentido, varios de los cultivos presentaron capacidad de diferenciación miogénica, formando miotubos multinucleados, expresando marcadores miogénicos y transactivando un promotor heterólogo específico de tejido muscular. Estos cultivos podrían representar un modelo celular para el estudio de aspectos relacionados con el proceso de diferenciación miogénica en la especie ovina. A continuación, se generaron vectores de expresión con las secuencias aisladoras (dos copias en tándem del core de 250 pb) flanqueando un cassette de expresión, constituido por un promotor de expresión constitutiva (PGK) regulando la expresión del gen reporter de la proteína verde fluorescente (GFP). El porcentaje de células que expresaban el transgén y los niveles de expresión se examinaron mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo en pools de clones transfectados establemente. En primer lugar, se planteó si el core del aislador cHS4 podía proteger del silenciamiento al transgén introducido en las células SBFF, y si la orientación de las copias del aislador respecto al cassette de expresión influía sobre el efecto observado. Nuestros resultados indicaron que el aislador cHS4 mostraba actividad barrera independientemente de su orientación. A continuación, se quiso comprobar si el contexto celular podía afectar a la actividad del aislador (se transfectaron las células ovinas en paralelo con células murinas), y si los resultados obtenidos eran reproducibles con otros promotores de uso frecuente en transgénesis (CMV y EF1a). Se detectó una interacción significativa entre el efecto del aislador y el tipo de promotor utilizado. Por otro lado, el comportamiento del aislador en las células ovinas fue comparable al de la especie murina, en la que los beneficios de este tipo de secuencias están más contrastados. La actividad barrera del aislador se mantuvo en condiciones de expresión específica de tejido observándose que, en presencia de cHS4 no sólo se incrementaba el número de clones con expresión homogénea del transgén GFP, sino que los niveles de expresión eran superiores a los de células equivalentes sin el aislador. Para completar estos estudios, se comparó la actividad barrera de cHS4 con la del aislador del locus de la tirosinasa de ratón (secuencia GAB, de 550 pb). En las células SBFF, la secuencia GAB resultó tan eficaz como cHS4 para la protección frente al silenciamiento del transgén GFP, lo que sugiere que el aislador GAB murino, podría ser una alternativa eficiente a la secuencia core del aislador cHS4. En conjunto, nuestros resultados confirman que el aislador de la beta-globina de pollo es una herramienta útil para mejorar la expresión de transgenes en fibroblastos fetales ovinos empleados como donantes de núcleo en transferencia nuclear.