Desarrollo de dos cepas atenuadas de "Salmonella enterica serovar choleraesuis" como vehículos para vacunas de ADN y expresión de un antígeno modelo

Resumen

En el campo de la sanidad animal la estrategia más rentable y segura en la profilaxis de las enfermedades infecciosas consiste en el empleo de vacunas. Una de las estrategias más económicas y eficaces para desarrollar estas vacunas es el uso de cepas vacunales vivas atenuadas. Estas cepas presentan como ventaja añadida la posibilidad de ser utilizadas como vehículos vacunales, tanto para liberar vacunas de ADN (que se ha denominado recientemente como bactofección) como para expresar antígenos heterólogos. Con estos antecedentes, en esta Tesis hemos construido dos cepas atenuadas a partir de Salmonella enterica serovar Choleraesuis mediante la deleción, utilizando el sistema ?Red recombinasa, de dos reguladores de virulencia, el sistema PhoP/PhoQ y RpoS. Los mutantes obtenidos son similares fenotípicamente a la cepa parental y presentan un alto grado de atenuación en los modelos murino y porcino de infección experimental. Para evaluar el comportamiento de las nuevas cepas al entrar en contacto con las células del hospedador, realizamos un experimento de infección de cultivos primarios con fibroblastos y macrófagos procedentes de lámina propia intestinal de cerdo por su papel como células fundamentales en la vía de entrada del patógeno. Es destacable cómo los mutantes construidos presentan un fenotipo de persistencia en macrófagos y de proliferación en fibroblastos viables en comparación con la cepa parental y, especialmente, con respecto a una cepa mutante atenuada presente en el mercado como vacuna comercial denominada SC-54. Una vez comprobada la atenuación y el fenotipo de persistencia y proliferación en cultivos celulares normalmente no permisivos para S. Choleraesuis, podemos considerar a ?phoP/Q y ?rpoS como excelentes candidatos para desarrollar vehículos vacunales adaptados al cerdo como hospedador. Basándonos en estos resultados, hemos optimizado los vehículos vacunales empleando un epítopo modelo comercial, 3xFLAG, con el fin de medir su capacidad para estimular una respuesta inmunitaria específica frente al antígeno vehiculado. [ABSTRACT]Vaccination is an increasingly important measure for the prevention of most of the infectious diseases that affect animals. The development of ideal vaccines represents a highly profitable and safe strategy. The use of live attenuated Salmonella spp strains as a delivery system for DNA vaccines and foreign antigens is a great opportunity for the development of ideal vaccines, affordable and also effective. Increased understanding of the mechanisms underlying Salmonella virulence and host immune response would create novel strategies to develop this vector strains. Due to their ability to target immune cells, the specific method used to cross the intestinal barrier and also their host-restricted tropism, Salmonella enterica serovar Choleraesuis live attenuated strains had attracted a great deal of interest as ideal oral vaccines and delivery vectors. In recent years, the ?Red recombinase system using bacteriophage-encoded recombinase has been developed to allow more efficient and precise manipulation of chromosomal DNA in bacterial species, so we have applied this technology in order to design two Salmonella enterica serovar Choleraesuis derivatives that carry deletions in phoP and rpoS regulatory genes. No differences have been observed between the mutants and parental strains phenotype´s characteristics. Both Salmonella derivatives are attenuated not only in the murine model but also, in the natural host model of infection. Both strains, ?phoP/Q y ?rpoS, were able to survive and proliferate inside eukaryotic cells belonging to primary cells cultures from swine lamina propria, macrophages and fibroblasts. These cells are located in the initial site of entry for Salmonella and their interaction with the bacteria are crucial for the development of host immunological responses. Moreover, the parental strain and a comercial available vaccine, SC-54, which is also a Salmonella enterica serovar Choleraesuis derivative, were not able to survive or proliferate inside macrophages or fibroblasts. ?phoP/Q y ?rpoS are likely to be considered as new candidates that raise a novel concept for promising vaccines in which a combination of intracellular survive and proliferation in macrophages and fibroblasts, respectively, together with attenuation in the porcine model of infection would be important characteristics. Therefore, We have optimized our vaccine delivery vectors with the aim to asses their power to stimulate a specific immunological host response against a model antigen, 3xFLAG.